[發明專利]用于肉制品中鴨源性成分快速鑒別的鎖核酸探針熒光定量PCR方法及其引物和鎖核酸探針序列

在審

• 申請號: 201510212812.7
• 申請日: 2015-04-29
• 公開（公告）號: CN105671035A
• 公開（公告）日: 2016-06-15
• 發明（設計）人: 許如蘇;魏霜;周廣彪;劉中勇;段建發;陳冠武;蘇建暉
• 申請（專利權）人: 中華人民共和國汕頭出入境檢驗檢疫局
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及動物源性成分鑒定技術領域，具體涉及用鎖核酸探針熒光定量PCR檢測肉制品中鴨源性成分的方法及其引物和鎖核酸探針序列。

背景技術

由于肉價差巨大，利益的誘惑導致肉類食品“摻假使假”事件頻發，2013年的歐洲馬肉丑聞席卷了瑞典、英國、法國、愛爾蘭、荷蘭、羅馬尼亞等多個國家，引起了各國人民的不安與憤懣，也引起了各國政府的重視而紛紛開展肉食品“摻假使假”調查。BALLIN等對近千種肉制品的檢測發現，有近20%的產品存在標識與品種不完全相符現象。2013年上海市食安辦在查處問題羊肉時意外發現豬肉鴨肉摻假。山東鄆城警方搗毀一處生產加工偽劣牛羊肉卷的窩點時發現“肥牛”實為牛肉加牛脂肪再加鴨肉做成，“羔排”是羊肉和鴨肉的混合產品，而鴨肉的摻雜比例最高達70%。2014年羊城晚報委托某機構對珠海部分農貿市場出售的“肥羊”進行檢測，結果顯示送檢的7份產品全部涉嫌摻假，除了羊肉，這些產品還摻雜了牛肉、鴨肉和馬肉。因此，打擊肉制品摻假成為近年來我國肉制品監管的重點，而打擊肉制品摻假首先需要對肉制品的肉種成分進行快速鑒別。

對肉制品的肉種成分鑒別主要基于對動物源性成分的鑒別。雖然動物源性成分的鑒別方法很多，但以檢測DNA為基礎的分子生物學方法，尤其是PCR技術以穩定、準確、快速等優勢而得到廣泛的應用。然而，食品中DNA成分復雜，加之PCR技術的高靈敏度，使得應用PCR方法來鑒別物種存在因非特異性擴增而產生假陽性結果的缺點。因此，以PCR為基礎，應用改良的引物探針設計策略已逐步成為肉類鑒別的新方向。

鎖核酸探針熒光探針是在Taqman探針的基礎上，有目的地將探針的一些堿基修飾成LNA堿基，而每增加一個單體LNA分子可提升Tm值3-8℃,還可通過調整LNA堿基在探針中的位置來調節最佳Tm值和鎖核酸探針雜交的特異性，從而增加探針的穩定性、特異性和設計的靈活性。目前，鎖核酸探針熒光定量PCR已在病原檢測、基因突變檢測等方面得到廣泛應用。本研究利用鎖核酸探針熒光探針的上述優點，建立肉制品中鴨源性成分的鎖核酸探針熒光定量PCR檢測方法，為動物源性成分的檢測提供了新的途徑。

發明內容

本發明的目的是提供一種用于肉制品中鴨源性成分快速鑒別的鎖核酸探針熒光定量PCR方法及其引物和鎖核酸探針序列。包括：

⑴所述的引物和鎖核酸探針的序列：

上游引物：5’-ACCTTCCCGCACCCTCTAAT-3’；

下游引物：5’GGCAGATGGCGAGCAGAGAT-3’；

鎖核酸探針：

5’-CY5-ATCTCYG+CYTGATGAAACTTCGG-BHQ3-3’

(2)采用步驟(1)設計的引物和探針建立鴨源性成分的鎖核酸探針熒光PCR檢測方法。其特征在于：熒光PCR檢測的反應體系為：20μL，包括10μLProbesMaster2×conc(包含有dNTP，Mg2+以及Taq酶等)，步驟(1)設計的10μmol/L上下游引物F/R各0.8μL，10μmol/LTaqman-LNA探針P0.3μL，DNA模板1μL，超純水補至20μL。反應參數：95℃8min；95℃，8s，58℃，25s（采集熒光信號），35～40循環。

基于本發明建立的鎖核酸探針熒光PCR檢測方法，按下列步驟進行：

1）樣品的制備與DNA模板的提取：

取上述樣品25g，剪碎后，加去離子水制成1:4勻漿，吸取勻漿50μL于1.5mL離心管內，按組織核酸提取（離心柱法）試劑盒使用說明操作，提取DNA備檢。

2）將試劑從冰箱取出后，置室溫融化，8000rpm離心10sec。根據樣品數按下表計算試劑用量。