[發明專利]一株近平滑假絲酵母重組菌高效制備(S)-苯基乙二醇的方法

在審

• 申請號: 201510206811.1
• 申請日: 2015-04-28
• 公開（公告）號: CN104774778A
• 公開（公告）日: 2015-07-15
• 發明（設計）人: 張榮珍;徐巖;李堯慧
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12N15/53;C12P7/22;C12R1/72
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所(普通合伙) 32104
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

一株近平滑假絲酵母重組菌高效制備(S)-苯基乙二醇的方法，構建(S)-羰基還原酶II在近平滑假絲酵母中的表達質粒，實現(S)-羰基還原酶II在近平滑假絲酵母中的原位表達，高效制備(S)-苯基乙二醇的方法，本發明涉及基因工程手段構建(S)-羰基還原酶II在近平滑假絲酵母的重組菌，高效制備(S)-苯基乙二醇的方法及其應用，屬于生物催化不對稱轉化技術領域。

背景技術

手性化合物在醫藥、農藥、激素、食品添加劑等精細化工領域應用廣泛，如光學純苯基乙二醇不僅是液晶材料中不可缺少的重要手性添加劑，而且是制備具有光學活性的醫藥、農藥和功能材料的重要中間體。

氧化還原酶催化的不對稱還原反應常用于手性化合物的制備。目前常用的氧化還原酶大部分來源于重組大腸桿菌。然而在大腸桿菌中重組表達后的氧化還原酶功能由于缺乏后期的蛋白后修飾，催化轉化手性化合物的效率不盡如人意。

本實驗室前期已經利用(S)-羰基還原酶II的大腸桿菌重組菌催化不對稱轉化制備(S)-苯基乙二醇。(S)-羰基還原酶II在大腸桿菌中異源表達后，利用大腸桿菌全細胞不對稱轉化2-羥基苯乙酮，獲得的(S)-苯基乙二醇的光學純度和得率分別只有89.1%和82.6%。在此基礎上，從近平滑假絲酵母(C.?parapsilosis)基因組中調取目的基因scrII，同時構建近平滑假絲酵母中的表達質粒pCP，在原有的(S)-羰基還原酶II在近平滑假絲酵母中本底表達的水平上，通過同源重組將目的基因scrII整合入近平滑假絲酵母基因組，增強了(S)-羰基還原酶II的催化功能。通過優化生物轉化反應條件，近平滑假絲酵母重組菌株催化底物2-羥基苯乙酮，產物(S)-苯基乙二醇光學純度和產率均達到99.9%。

發明內容

（1）要解決的技術問題

本發明目的在于根據已經獲得的近平滑假絲酵母(C.?parapsilosis)?(S)-羰基還原酶II基因scrII?(GenBank?accession?No.GQ411433)，通過將scrII整合入近平滑假絲酵母基因組，構建(S)-羰基還原酶II的近平滑假絲酵母重組菌株。利用該重組菌催化2-羥基苯乙酮高效制備具有光學活性的(S)-苯基乙二醇，該重組菌不對稱還原2-羥基苯乙酮制備光學活性(S)-苯基乙二醇，產物的光學純度和產率高達99.9%，為利用新型重組酵母菌株高效制備手性化合物提供了有效途徑。

（2）技術方案

一株不對稱轉化制備(S)-苯基乙二醇的原位表達(S)-羰基還原酶II的近平滑假絲酵母重組菌，其分類命名為近平滑假絲酵母菌/(S)-羰基還原酶II（C?parapsilosis?pCP-scrII），已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號：CCTCC?NO：M2015107。

一、基因組的獲得

野生型近平滑假絲酵母(C.?parapsilosis)CCTCC?NO：M203011生長培養基YPD組成質量百分為：葡萄糖2%，酵母膏1%，蛋白胨2%。將近平滑假絲酵母菌接種于培養基裝液量為30%?的250?mL搖瓶中于28℃、200?r/min振蕩培養16-18?h。培養結束后，將菌體于12,000?r/min離心5?min，用生理鹽水洗滌兩次后收集細胞。利用基因組DNA提取試劑盒Genomic?DNA?Mini?Preparation?Kit（Takara公司）提取基因組。

二、scr?II基因的調取

從近平滑假絲酵母中調取目的基因的同時，將目的基因中酶切位點Kpn?I序列（GGTACC）同義突變為GGCACA。

以近平滑假絲酵母基因組為PCR反應模板，利用含有Sac?I和Kpn?I限制性酶切位點的引物SCRII_Sac?I_F1和SCRII_Kpn?I_R1，以及Kpn?I突變點引物Mut_Kpn?I_F2和Mut_Kpn?I_R2：

合成兩端引物：