[發明專利]一株近平滑假絲酵母重組菌高效制備(S)-苯基乙二醇的方法

在審

• 申請號: 201510206811.1
• 申請日: 2015-04-28
• 公開（公告）號: CN104774778A
• 公開（公告）日: 2015-07-15
• 發明（設計）人: 張榮珍;徐巖;李堯慧
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12N15/53;C12P7/22;C12R1/72
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所(普通合伙) 32104
• 代理人: 時旭丹;劉品超

1.一株不對稱轉化制備(S)-苯基乙二醇的原位表達(S)-羰基還原酶II的近平滑假絲酵母重組菌，其分類命名為近平滑假絲酵母菌/(S)-羰基還原酶II（Candida?parapsilosis?pCP-scrII），已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號：CCTCC?NO：M2015107。

2.利用權利要求1所述的原位表達近平滑假絲酵母重組菌不對稱轉化制備(S)-苯基乙二醇的方法，其特征是將(S)-羰基還原酶II在近平滑假絲酵母中表達后，利用培養后的重組菌株C?parapsilosis?pCP-scrII，以2-羥基苯乙酮為底物，催化不對稱轉化反應：在1?mL?0.1?mol/L?pH?4.5~5.5的醋酸緩沖液中，或1?mL?0.1?mol/L?pH?6.0~7.0的磷酸緩沖液中，或1?mL?0.1?mol/L?pH?7.5~9.0的Tris-HCl緩沖液中，加入重組菌細胞濃度為0.1?g/mL，底物2-羥基苯乙酮濃度為6?g/L，反應溫度20-40℃，反應時間45?h。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征是重組菌株C?parapsilosis?pCP-scrII的培養：

生長培養基YPD以g/L計：胰蛋白胨20，酵母提取物10，葡萄糖20，以去離子水配制；固體培養基添加瓊脂粉?20；

發酵培養基以g/L計：酵母提取物5，葡萄糖40，(NH₄)₂HPO₄?13，KH₂PO₄?7，ZnSO₄·7H₂O?0.3，NaCl?0.1，pH?7.0，以去離子水配制；

培養條件：挑取重組菌株C?parapsilosis?pCP-scrII的單菌落接種于5?mL?YPD液體培養基中，于28℃、200?r/min振蕩培養12?h；取1?mL培養液轉接于50?mL?發酵培養基中，于28℃、200?r/min振蕩培養36?h。

4.根據權利要求2所述的方法，其特征是重組菌株C?parapsilosis?pCP-scrII的構建：

將帶有Kpn?I同義突變位點的目的基因scrII插入大腸桿菌和近平滑假絲酵母表達載體pCP中，構建重組質粒pCP-scrII，重組質粒pCP-scrII轉化近平滑假絲酵母感受態細胞，通過含有40?μg/mL諾爾斯菌素的YPD平板篩選目的重組菌株C.?parapsilosis?pCP-scrII。