[發明專利]一種葡萄座腔菌的檢測方法

有效

• 申請號: 201510201075.0
• 申請日: 2015-04-25
• 公開（公告）號: CN104774955A
• 公開（公告）日: 2015-07-15
• 發明（設計）人: 高文娜;況衛剛;鄭春生;駱衛峰;張百怡
• 申請（專利權）人: 向華
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/645
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種葡萄座腔菌的檢測方法，尤其是指葡萄座腔菌的三重實時熒光PCR檢測方法，屬于檢驗檢疫技術領域。

背景技術

葡萄座腔菌科(Botryosphaeriaceae)真菌寄主范圍廣泛，不僅存在于土壤中也作為內生真菌寄生于健康植株，遇到適宜環境條件便侵染植株引發病害，導致植株發生枯萎、腐爛和潰瘍等病害。蘋果殼色單隔孢潰瘍病菌(Botryosphaeria?stevensii以及Botryosphaeria?obtusa，Botryosphaeria?dothidea)是我國進境檢疫性有害生物，產生毒素嚴重危害蘋果、梨、葡萄等多種果樹，對蘋果產業造成巨大的經濟損失。

對病原菌的準確、快速檢測鑒定是研究病害發生、發展及群體結構的重要基礎，然而利用傳統的病原菌分離方法對田間病樣進行分離鑒定，需要消耗大量時間，同時要求鑒定人員具備專業的病原菌鑒定技能。葡萄座腔菌可用于分類的有性態特征較少，且很難用培養基培養，因此目前鑒定葡萄座腔菌主要根據其無性態特征來進行鑒定，但是該屬真菌無性態特征不穩定，容易受環境條件的影響。因此，開發一種對該類真菌快速、準確的檢測方法，對田間病害的發生發展進行監測具有重要的意義。

中國專利申請201210229358、發明名稱“葡萄潰瘍病菌快速檢測引物及其應用”公開了一種利用PCR技術檢測葡萄潰瘍病菌的技術，其中使用了特異性引物組，能夠對多種葡萄潰瘍病菌以及葡萄穗軸褐枯病菌、葡萄枝枯病菌、葡萄炭疽病菌、葡萄灰霉病菌、葡萄白腐病菌、葡萄蔓枯病菌具有良好的檢測效果。

馮小慧等(楊樹潰瘍病病原的多重PCR檢測技術，2012)公開了利用多重PCR檢測技術檢測4種楊樹潰瘍病病原菌株(Botryosphaeria?dothidea，Valsa?sordida，Leucostoma?sp.，Valsa?ambiens)取得了良好的檢測效果。然而，該方法仍然使用傳統的PCR技術，需要對PCR擴增結果進行分離鑒定，因此在設計引物時需要考慮擴增產物的區分度，同時不能適用本發明待測的三種病原菌，從而制約了相關應用。

實時熒光PCR技術是在常規PCR基礎上發展起來的一種核酸定量技術，利用熒光信號的積累實現對整個PCR過程的實時監控。整個反應在一個密閉的狀態下進行，不需要進行后續的試驗就能夠獲得結果，有效減少了樣品間的交叉污染，靈敏度高，目前正廣泛用于病原菌及病毒的檢測鑒定中。

中國專利申請200910236112、發明名稱“檢測葡萄苦腐病菌的引物和探針及其檢測方法”和中國專利申請201310631946、發明名稱“葡萄莖枯病菌的實時熒光PCR檢測試劑及檢測方法”均公開了熒光定量PCR特異性檢測葡萄疫病的技術，其中通過設計高特異性引物和高靈敏度熒光探針的組合，能夠獲得良好的檢測效果。

黃海泉(“實時熒光定量PCR技術在植物檢疫中應用的研究進展”，《湖北農業科學》，2012年)報道了實時熒光定量PCR技術已經廣泛用于真菌引起的植物病蟲害檢測中，但該文指出目前仍然沒有合適的實時熒光PCR技術來檢測三種葡萄座腔菌(B.stevensii，B.obtusa，B.dothidea)。

盡管多重熒光PCR法具有常規多重PCR不具有的優點，但其使用的熒光基團數量有限，淬滅染料或基團也可發生熒光，從而造成一定干擾。此外，影響多重PCR最重要的因素是多重引物之間的相容性。理想狀態下是所有引物對有相同的擴增效率和解鏈溫度，這樣在同一溫度下互補鏈才能分離，擴增才能同時進行，而解決這一問題最主要的是引物退火溫度要相同或盡可能相近。因此，退火溫度和時間以及延伸時間對擴增影響較明顯，而循環次數影響較小。綜合所述，隨著引物對增加，各引物對的解鏈溫度差過大，以及選用不合適的熒光探針和淬滅基團，多重PCR難度也會增加，從而影響了多重熒光PCR的檢測準確度，

由于以上三種葡萄座腔菌嚴重危害我國蘋果產業的生產，因此目前急需一種實時熒光PCR技術來有效檢測以上三種葡萄座腔菌。

發明內容

本發明原理在于選擇特殊設計的引物，并放棄使用相同類型的熒光基團，而設計不同類型的熒光基團來修飾探針，從而為多重實時PCR檢測葡萄座腔菌提供新的檢測方法。因此，本發明要解決的技術問題是提供一種快速、準確、高通量三重熒光定量PCR檢測三種葡萄座腔菌(B.stevensii，B.obtusa，B.dothidea)的技術。

因此，本發明第一個目的在于提供一種三重熒光定量PCR的檢測組合物，包括：