[發(fā)明專利]一種葡萄座腔菌的檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510201075.0
• 申請(qǐng)日: 2015-04-25
• 公開（公告）號(hào): CN104774955A
• 公開（公告）日: 2015-07-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 高文娜;況衛(wèi)剛;鄭春生;駱衛(wèi)峰;張百怡
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 向華
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/645
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種三重?zé)晒舛縋CR的檢測(cè)組合物，包括：

B.stevensii引物Bst-F:TCATCGAGAAGTTCGAGAAGGTAAG(SEQ?ID?No.1)

B.stevensii引物Bst-R：CAAGTGCGGCCAGTTTGC(SEQ?ID?No.2)

B.stevensii探針Bst-T：TGCGCTTATCTGCCGCCGTG(SEQ?ID?No.3)

B.obtusa引物Bob-F：TCATCGAGAAGTTCGAGAAGGTAAG(SEQ?ID?No.1)

B.obtusa引物Bob-R：CAAGTGCGGCCAGTTTGC(SEQ?ID?No.2)

B.obtusa探針Bob-T：ACAGCCCACCTTATCGCTCGGTGAG(SEQ?ID?No.4)

B.dothidea引物Bod-F：TCATCGAGAAGTTCGAGAAGGTAAG(SEQ?ID?No.1)

B.dothidea引物Bod-R：GGAGATTTTGCCGAAGACCA(SEQ?ID?No.5)

B.dothidea探針Bod-T：ACATTTTCTGTGCCTGCACGTGTGCTG(SEQ?ID?No.6)。

2.權(quán)利要求1的檢測(cè)組合物，其中三條探針標(biāo)記的熒光基團(tuán)分別為FAM、NED、JOE，對(duì)應(yīng)的淬滅基團(tuán)為BHQ1、BHQ2、BHQ1。

3.權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)組合物，用于三重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)三種葡萄座腔菌的方法。

4.權(quán)利要求3的方法，包括以下步驟：

(1)采集待測(cè)樣本；

(2)提取樣本基因組DNA；

(3)用多重實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)；

其中，所述三種葡萄座腔菌選自B.stevensii，B.obtusa，B.dothidea。

5.權(quán)利要求4的方法，其中所述步驟(2)提取樣本基因組DNA，是采用的是磁珠提取法。主要步驟如下：取研磨液放置于1.5mL離心管中；向離心管中加入600μL裂解液，渦旋震蕩混勻15s，室溫靜置10min，12000rpm離心2min；取200μL上清于新的離心管中，加入200μL磁珠，震蕩混勻，靜置10min，收集磁珠，棄上清；加入500μL洗滌液，棄廢液收集磁珠；加入500μL無水乙醇洗滌，棄廢液收集磁珠；加入70％乙醇洗滌，棄廢液收集磁珠；加入50TE?buffer溶解，吸取上清液至新的EP管中，備用。

6.權(quán)利要求5的方法，其中所述步驟(3)用多重實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)，是指用以下引物和探針序列進(jìn)行反應(yīng)：鑒定B.stevensii引物為Bst-F和Bst-R，探針為Bst-T；鑒定B.obtusa引物為Bob-F和引物Bob-R，探針為Bob-T；B.dothidea引物為Bod-F和Bod-R，探針為Bod-T。

7.權(quán)利要求3-6的方法，其中所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系總體積為25μL，三種真菌DNA模板同時(shí)擴(kuò)增會(huì)產(chǎn)生干擾，對(duì)整個(gè)反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，最終多重實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)反應(yīng)體系如下：

樣本基因組DNA?2μL；

2xTaqman?Express?PCR?Master?Mix(Applied?Biosystems,USA)，12.5μL；

B.stevensii探針Bst-T：0.25μL，濃度為10μmol/L；

B.obtusa探針Bob-T：0.25μL，濃度為10μmol/L；

B.dothidea探針Bod-T：0.25μL，濃度為10μmol/L；

B.stevensii引物Bst-F：1μL，濃度為10μmol/L；

B.stevensii引物Bst-R：0.5μL，濃度為10μmol/L；

B.dothidea引物Bod-R：0.5μL，濃度為10μmol/L；

RNase-free?Water，7.75μL。