[發明專利]一種檢測人類胚胎染色體微缺失和微重復的方法

有效

• 申請號: 201510198145.1
• 申請日: 2015-04-23
• 公開（公告）號: CN104745718B
• 公開（公告）日: 2018-02-16
• 發明（設計）人: 馮濤;楊凱;邢麗賢
• 申請（專利權）人: 北京中儀康衛醫療器械有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869
• 代理公司: 北京名華博信知識產權代理有限公司11453
• 代理人: 張玉樞

技術領域

本發明涉及分子細胞生物領域，具體涉及一種檢測人類胚胎染色體微缺失和微重復的方法，其能夠對人類胚胎囊胚期滋養層細胞染色體DNA片段拷貝數變異進行檢測。

背景技術

染色體微缺失/微重復是指染色體上出現長度為1.5kb-10Mb的缺失或重復。人類染色體微缺失/微重復綜合征是一種因人類染色體上出現微小片段缺失或重復，即DNA片段拷貝數變異，縮寫為CNV，引起復雜表型疾病，可導致嚴重的疾病和異常，如先天性心臟病、生長發育遲緩、肢體畸形等。常見的微缺失綜合征包括22q11微缺失綜合征、貓叫綜合征、安格曼綜合癥、AZF缺失等。

2009《中國不孕不育現狀調研報告》顯示，全國不孕不育患者人數已超過5000萬，而試管嬰兒技術能夠有效幫助不孕不育患者解決生育難題。試管嬰兒技術是將卵子與精子取出后置于特定的培養液內培養、受精，受精卵在恒溫孵箱中發育為胚胎后移植回母體子宮，最終發育成胎兒。試管嬰兒技術作為有效的輔助生殖手段成為大多數不孕不育夫婦的重要選擇，而挑選健康胚胎移植是成功妊娠的關鍵。但是，通過試管嬰兒方法獲得的胚胎有40-60%存在染色體異常，且隨著孕婦年齡越大，胚胎染色體異常的風險越高，而染色體異常是導致妊娠失敗和自然流產的主要原因，因此，對于植入前的胚胎進行遺傳學篩查是至關重要的。胚胎植入前遺傳學篩查是指胚胎植入著床之前進行染色體數目和結構異常的檢測，挑選正常的胚胎植入子宮，以期獲得正常的妊娠，提高患者的臨床妊娠率。除了常見的3體綜合癥外，微缺失和微重復也是胚胎染色體異常的常見類型。

盡管每種微缺失綜合征發病率都很低，如較常見的22q11微缺失綜合征發生率為1：4000，但由于臨床檢測技術的限制，大量的微缺失綜合征患者在產前篩查和產前診斷中無法檢出，更為重要的是作為胚胎植入前診斷的最主要的樣本類型，平衡易位患者的胚胎必須通過分析微重復和微缺失來判定胚胎是否發生異常。因此，如果在試管嬰兒技術中能夠避免移植有染色體微缺失/微重復的胚胎，將具有很重要的意義。

此外，試管嬰兒通常會進行多個卵子的體外受精，但為了避免多胎妊娠給孕婦和胎兒帶來的風險，移植的胚胎數目最好是1個。為了提高妊娠率，必須對移植的胚胎進行篩選，從而對質量最佳的胚胎進行移植。目前胚胎質量的評估主要依賴于胚胎的形態判斷，但胚胎的形態和最終的成功懷孕之間的關聯性還不夠高。理論上，對胚胎的染色體進行檢查是篩選優質胚胎的最佳途徑。胚胎染色體檢測的最大瓶頸是可以用于檢測的細胞數量太少。

現有的針對微缺失/微重復綜合征的診斷方法主要有高分辨率染色體核型分析、熒光原位雜交、微陣列-比較基因組雜交、多重連接探針擴增技術和定量PCR的方法等。

高分辨率染色體核型分析采用細胞同步化的方法，通過獲得大量優質的有絲分裂晚前期或早中期的顯帶核型，使單套染色體的條帶數量增至數百條以上，從而提高識別染色體細微結構改變的能力，但其分辨率的極限只有約5M，不足以檢測更小的染色體水平上的微缺失/微重復變異。而且由于胚胎細胞數量的有限，也無法獲得足夠的染色體。

熒光原位雜交，縮寫為FISH，是微缺失/微重復檢測的黃金標準，其可以有效地檢測出大部分染色體缺失。如果被檢測的染色體或DNA與所用的核酸探針是同源互補的，二者經變性-退火-復性，即可形成靶DNA與核酸探針的雜交體，而經熒光檢測體系顯示核酸探針，即可對待測DNA進行定性、定量或相對定位分析。中期染色體FISH的分辨率可達1-2M，間期染色體FISH分辨率可達50K，但該技術需在已知缺失位點的情況下，設計探針進行驗證，不宜用于發現新的染色體水平的微缺失或重復異常。

微陣列-比較基因組雜交技術，縮寫為Array CGH，可將特異DNA片段作為靶探針固化在載體上形成微陣列，通過將熒光素標記的待測DNA和參考DNA與微陣列雜交從而檢測DNA拷貝數變異。Array CGH理論上可檢測5至10kb甚至更小的DNA序列，但該方法價格昂貴且一般并不覆蓋全基因組的所有位點。

多重連接探針擴增技術，縮寫為MLPA，是一種針對待測DNA序列進行定性和半定量分析的新技術。MLPA技術目前在臨床實驗室已應用于Y染色體微缺失、22q11.2染色體微缺失等的檢測，優點是高效、特異、快速、簡便，缺點是不適合檢測未知的點突變類型。

PCR方法常用于Y染色體微缺失方面的檢測，如Y染色體上與男性生殖相關的AZF基因，AZFa、AZFb、AZFc等的缺失則多用PCR的方法進行檢測。對于已知的染色體微缺失位點的驗證也可以用PCR方法。該方法簡便易行，缺點是只能針對已知位點進行檢測，且一次僅能針對幾個位點進行檢測。