[發明專利]利用SD-AS序列偶聯(R)-羰基還原酶與葡萄糖脫氫酶制備(R)-苯乙二醇的方法

在審

• 申請號: 201510195643.0
• 申請日: 2015-04-23
• 公開（公告）號: CN104830744A
• 公開（公告）日: 2015-08-12
• 發明（設計）人: 張榮珍;徐巖;周曉天
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/53;C12N9/04;C12P7/22;C12R1/19
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所(普通合伙) 32104
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

利用SD-AS序列連接(R)-羰基還原酶與葡萄糖脫氫酶，不對稱轉化制備(R)-苯乙二醇的方法，本發明涉及基因工程技術使兩種酶共表達，構建重組大腸桿菌，用于高效制備(R)-苯乙二醇的方法及其應用，屬于生物催化不對稱轉化技術領域。

背景技術

手性化合物在醫藥和農藥等精細化工品的制備中應用廣泛，如光學純苯乙二醇是制備具有光學活性的醫藥、農藥和功能材料的重要中間體，也是液晶材料中不可缺少的重要手性添加劑。

氧化還原酶能催化不對稱還原反應，制備手性化合物。這類反應需要輔酶尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺,?NADH）或尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP⁺,?NADPH）參與。但由于輔酶價格昂貴，且化學性質不太穩定，不能用一般的合成物質替代。在手性化合物制備過程中，輔酶不能再生是限制氧化還原酶催化反應的主要“瓶頸”因素。

葡萄糖脫氫酶（GDH）是一種“輔酶再生”功能酶，常用于NAD(H)和NADP(H)的循環再生，它使葡萄糖氧化生成葡萄糖酸，同時使氧化態輔酶NAD(P)^＋還原為NAD(P)H。倪燕等將來源于Bacillus?subtilis的羰基還原酶基因與葡萄糖脫氫酶基因置于同一個啟動子下進行共表達，用于制備(R)-氯-羥基丁酸乙酯，產物的光學純度和得率分別為99.6%和91.7%；Ema等將來自于Saccharomyces?cerevisiae的羰基還原酶和Bacillus?megaterium的葡萄糖脫氫酶置于同一質粒中的兩個啟動子下表達，合成S-2-羥基-4-辛酮的光學純度為100%。

本實驗室已經利用(R)-羰基還原酶的重組菌株催化不對稱轉化制備(R)-苯乙二醇，但是產物的光學純度和得率為81%和61%。在此基礎上，利用SD-AS序列作為連接子，偶聯近平滑假絲酵母(Candida?parapsilosis)?CCTCC?NO：M203011?(R)-羰基還原酶和芽孢桿菌（Bacillus?sp.?YX-1）葡萄糖脫氫酶，構建重組E.?coli?RIL菌。該重組菌進行生物轉化(R)-苯乙二醇時，不僅很好地提高了產物的轉化效率，反應時間由48?h縮短為24?h，且轉化過程不需要添加輔酶。采用SD-AS連接子，偶聯(R)-羰基還原酶和葡萄糖脫氫酶，加強輔酶代謝循環解決輔酶限制性的問題，實現了重組菌高效制備(R)-苯乙二醇。

發明內容

（1）要解決的技術問題

本發明目的在于利用SD-AS序列為連接子，偶聯(R)-羰基還原酶基因(RCR)與Bacillus?sp.?YX-1的葡萄糖脫氫酶基因（GDH），實現兩個酶的并表達，利用雙酶偶聯重組大腸桿菌（E.?coli?RIL/pET-R-SD-AS-G）催化2-羥基苯乙酮，高效制備(R)-苯乙二醇，解決手性催化反應中輔酶限制性的問題，顯著提升了酶的催化功能和催化效率。

（2）技術方案

一株不對稱轉化制備(R)-苯乙二醇的雙酶共表達重組菌，其分類命名為大腸桿菌Escherichia?coli?RIL/pET-R-SD-AS-G，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號：CCTCC?NO：M?2015170。

一、質粒pET-RCR及pET-GDH的獲得

重組E.?coli?JM109/pET-RCR和重組E.?coli?JM109/pET-GDH的培養基組成以g/L計：蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl?10，pH?7.0，以去離子水配制；

將兩種重組菌分別接種于培養基裝液量為5?mL試管中于37℃、200?rpm振蕩培養8?h。培養結束后，將菌體于12,000?rpm離心1min收集細胞，利用質粒提取試劑盒Mini-Plasmid?Rapid?Isolation?Kit（北京博大泰克生物基因技術有限公司）提取質粒pET-RCR及pET-GDH。

二、RCR和GDH共表達重組大腸桿菌的構建

合成兩端引物：