[發明專利]利用SD-AS序列偶聯(R)-羰基還原酶與葡萄糖脫氫酶制備(R)-苯乙二醇的方法

在審

• 申請號: 201510195643.0
• 申請日: 2015-04-23
• 公開（公告）號: CN104830744A
• 公開（公告）日: 2015-08-12
• 發明（設計）人: 張榮珍;徐巖;周曉天
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/53;C12N9/04;C12P7/22;C12R1/19
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所(普通合伙) 32104
• 代理人: 時旭丹;劉品超

1.一株不對稱轉化制備(R)-苯乙二醇的雙酶共表達重組菌，其分類命名為大腸桿菌Escherichia?coli?RIL/pET-R-SD-AS-G，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號：CCTCC?NO：M?2015170。

2.利用權利要求1所述的雙酶共表達重組菌Escherichia?coli?RIL/pET-R-SD-AS-G不對稱轉化制備(R)-苯乙二醇的方法，其特征是將(R)-羰基還原酶RCR和葡萄糖脫氫酶GDH相偶聯，利用培養后的重組菌株，以2-羥基苯乙酮為底物，催化不對稱轉化反應：在2?mL?0.1?mol/L?pH?7.5的磷酸緩沖液中，加入重組大腸桿菌濕菌體濃度為0.1?g/mL，2-羥基苯乙酮底物濃度為6?g/L，葡萄糖12?g/L，混勻后在35℃恒溫搖床上振蕩反應24?h。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征是重組菌株E.?coli?RIL/pET-R-SD-AS-G的培養：

LB培養基以g/L計：蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl?10，pH?7.0，以去離子水配制；固體培養基添加瓊脂粉15；

培養條件：挑取陽性克隆單菌落E.?coli?RIL/pET-R-SD-AS-G接種于10?mL含50?μg/mL硫酸卡那霉素的LB液體培養基中，于37℃、200?rpm振蕩培養過夜；取10?mL培養液轉接于1?L含50?μg/mL硫酸卡那霉素的LB液體培養基中，于37℃、200?rpm振蕩培養至OD₆₀₀為1.0；向培養物中加入誘導物異丙基-Β-D-硫代半乳糖苷?0.4?mmol/L，在培養溫度37℃下進行誘導培養10?h。

4.根據權利要求2所述的方法，其特征是重組菌株E.?coli?RIL/pET-R-SD-AS-G的構建：

采用SOE-PCR的方法，引入SD-AS序列，將目的基因(R)-羰基還原酶RCR和葡萄糖脫氫酶GDH通過SD-AS序列連接起來，插入表達載體pET-28a中，構建重組質粒pET-R-SD-AS-G，重組質粒轉化大腸桿菌E.?coli?RIL感受態細胞，通過含有50?μg/mL?硫酸卡那霉素的LB平板篩選目的重組菌株E.?coli?RIL/pET-R-SD-AS-G。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征是重組質粒pET-R-SD-AS-G的構建：

利用限制性內切酶NheI?和XhoI，對重疊延伸后的R-SD-AS-G基因與載體pET-28a分別進行雙酶切處理，處理后DNA片斷通過粘性末端連接，獲得重組質粒pET-R-SD-AS-G。