[發明專利]一種評價水產品微生物動態變化的方法

在審

• 申請號: 201510192425.1
• 申請日: 2015-04-22
• 公開（公告）號: CN104774952A
• 公開（公告）日: 2015-07-15
• 發明（設計）人: 郭清雄;艾春香
• 申請（專利權）人: 福建正源飼料有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 福州市鼓樓區博深專利代理事務所(普通合伙) 35214
• 代理人: 林志崢

技術領域

本發明涉及一種微生物的檢測方法，尤其涉及一種評價水產品微生物動態變化的方法。

背景技術

我國目前對于水產品的腸道內容物中的菌群檢測、鑒定手段仍停留常規的微生物學檢驗水平，通常以分離培養、生化試驗及血清學試驗為主，具有操作復雜、手工勞動量大、檢驗周期長、特異性不強等缺點。

焦磷酸測序技術是新一代DNA序列分析技術，該技術無須進行電泳，DNA片段也無須進行熒光標記，操作極為簡便。焦磷酸測序技術是由4種酶催化的同一反應體系中的酶級聯化學發光反應，在每一輪測序反應中，只加入一種dNTP，若該dNTP與模板配對，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數的焦磷酸基團(PPi)。PPi可最終轉化為可見光信號，并通過光學系統生成一個峰值。每個峰值的高度與反應中摻入的核苷酸數目成正比，然后加入下一種dNTP，繼續DNA鏈的合成。

焦磷酸測序中所使用的模板需要通過一種稱為emPCR的方法制備得到emPCR產物。目前基于焦磷酸測序原理的454高通量測序中的emPCR方法屬于常規技術，并且市場上也有開發相對成熟的商品可以直接應用。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是：本發明的目的是提供一種評價水產品微生物動態變化的方法，以彌補傳統常見水產品致病菌檢測技術存在的費時耗力的缺陷，提高檢測靈敏度和特異性，降低勞動強度，縮短檢測周期。

為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案為：提供一種評價水產品微生物動態變化的方法，包括步驟：將水產品微生物菌落進行454焦磷酸測序，所述454焦磷酸測序所需的emPCR產物的制備方法如下：

1)乳化油、擴增混合液和試劑準備；所述的擴增混合液包括下列各組分：emPCR?Additive，5×擴增液，擴增引物，emPCR酶混合液，PPiase，超純水。

2)水產品DNA文庫捕獲；

3)乳化；

4)擴增；

5)磁珠回收；

6)DNA文庫磁珠富集；

7)測序引物退火，即制得測序所用的emPCR產物。

優選的，上述的評價水產品微生物動態變化的方法中，所述水產品為大黃魚。

優選的，上述的評價水產品微生物動態變化的方法中，所述的擴增混合液包括下列各組分：350μL?emPCRAdditive，200μL?5×擴增液，35μL擴增引物，50μL?emPCR酶混合液，2μL?PPiase和290μL超純水。

優選的，上述的評價水產品微生物動態變化的方法中，所述454焦磷酸測序為基于焦磷酸原理的454高通量轉錄組測序。

優選的，上述的評價水產品微生物動態變化的方法中，所述步驟4)的擴增的反應程序如下所示：

a、95℃，3min；

b、95℃，35s；

c、60℃，5.5min；

d、72℃，35s；

步驟b至d共50個循環；

e、10℃保存。

本發明的有益效果在于：本發明將焦磷酸測序技術引入水產品中腸道菌落檢測，建立了一種快速、靈敏、準確性高、重復性強的全新的用于檢測水產品菌落的方法，利用本發明的評價水產品微生物動態變化的方法可以達到檢測水產品腸道菌落的目的，操作簡便，準確性高。

具體實施方式

為詳細說明本發明的技術內容、所實現目的及效果，以下結合實施方式予以說明。

本發明關鍵技術構思：本發明將焦磷酸測序技術引入水產品中腸道菌落檢測，建立了一種快速、靈敏、準確性高、重復性強的全新的用于檢測水產品菌落的方法。

實施例1

本發明提供一種評價水產品微生物動態變化的方法，包括步驟：將水產品微生物菌落進行454焦磷酸測序，所述454焦磷酸測序所需的emPCR產物的制備方法如下：

1)乳化油、擴增混合液和試劑準備；所述的擴增混合液包括下列各組分：emPCRAdditive，5×擴增液，擴增引物，emPCR酶混合液，PPiase，超純水。

2)水產品DNA文庫捕獲；

3)乳化；

4)擴增；

5)磁珠回收；

6)DNA文庫磁珠富集；

7)測序引物退火，即制得測序所用的emPCR產物。

優選的，上述的評價水產品微生物動態變化的方法，所述水產品為大黃魚