[發明專利]一種用于葉酸代謝能力評估的飛行質譜生物芯片及檢測方法和試劑盒

在審

• 申請號: 201510169415.6
• 申請日: 2015-04-10
• 公開（公告）號: CN104774944A
• 公開（公告）日: 2015-07-15
• 發明（設計）人: 何文迪;宋毅;楊菲
• 申請（專利權）人: 浙江博惠生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 杭州豐禾專利事務所有限公司 33214
• 代理人: 王從友

技術領域

本發明涉及一種用于葉酸代謝水平評估的飛行質譜生物芯片及檢測方法和試劑盒。

背景技術

葉酸在新鮮綠葉蔬菜中含量最多，食物中的葉酸經過膽汁和小腸中的γ-谷氨基羧肽酶(γ-glutamyl?carboxypeptidase)水解成蝶酰單谷氨酸和二谷氨酸始能吸收。吸收的葉酸以N5-甲基四氫葉酸的形式存在于血中，和白蛋白疏松結合運輸，通過葉酸受體被攝取進入細胞內，在維生素B12依賴的蛋氨酸合成酶作用下形成四氫葉酸而發揮作用。四氫葉酸在體內轉移一碳基團等過程中起輔酶作用。絲氨酸是一碳基團的來源，它和四氫葉酸作用形成N5。10-甲烯基四氫葉酸和甘氨酸；另一來源系在組氨酸分解代謝中的亞氨甲酰谷氨酸和四氫葉酸作用生成N5-亞氨甲酰四氫葉酸和谷氨酸。

MTHFR為亞甲基四氫葉酸還原酶蛋白編碼基因，主要作用是在葉酸代謝通路中將5，10-亞甲基四氫葉酸轉化為具有生物學功能的5-甲基四氫葉酸。5-甲基四氫葉酸可以進一步進入甲基傳遞通路，通過同型半胱氨酸的重新甲基化過程間接為DNA甲基化和蛋白質甲基化提供甲基并且使血液中的同型半胱氨酸水平保持在一個較低的水平。此外葉酸的中間代謝產物在核苷酸合成過程中也有重要的作用，通過一碳單位代謝為嘌呤環的形成提供碳原子。

甲硫氨酸是蛋白質合成和一碳代謝的必需氨基酸，它的合成是由甲硫氨酸合成酶(MTR基因編碼)催化的，MTRR編碼的甲硫氨酸合成酶還原酶能夠通過還原型甲基化作用重新生成具有功能活性的甲硫氨酸合成酶。

單核苷酸多態(SNP)，屬于DNA多態性的一種，指DNA序列中發生頻率大于1％的單堿基變異，包括單堿基轉換，顛換，插入或缺失等變化。SNP作為一種常見的遺傳變異，可能導致個體表型的差異以及不同個體對疾病，特別是復雜疾病的易感性，以及對環境因素和藥物及治療反應的差異。研究表明，MTHFR和MTRR基因缺陷的孕婦人群尤其需要補充葉酸，因此，檢測孕婦人群的MTHFR和MTRR基因SNP位點，尤其是MTHFR?C677T?rs1801133、MTRR?A1298C?rs1801131、酸甲硫氨酸合成酶還原酶MTRR?A66G?rs1801394位點，可作為補充葉酸的個性化膳食建議依據。

MassARRAY基因分析技術基于MALDI-TOF(基質輔助激光解吸電離)飛行時間質譜技術。先通過PCR擴增目標序列，然后加入SNP序列特異延伸引物，在SNP位點上延伸1個堿基。將制備的樣品分析物與芯片基質共結晶，將該晶體放入質譜儀的真空管，而后用瞬時納秒(10sec)強激光激發，由于基質分子經輻射所吸收的能量，導致能量蓄積并迅速產熱，從而使基質晶體升華，核酸分子就會解吸附并轉變為亞穩態離子，產生的離子多為單電荷離子，這些單電荷離子在加速電場中獲得相同的動能，進而在一非電場漂移區內按照其質荷比率加以分離，在真空小管中飛行到達檢測器。MALDI產生的離子用飛行時間(Time-of-Flight，TOF)檢測器來檢測，離子質量越小，就越快到達。利用質譜分析對質量的靈敏度特別高的特點，很容易將僅含有一個不同堿基的兩段基因序列區別開，推導出SNP分型。

發明內容

為了解決上述的技術問題，本發明的第一個目的是一種用于葉酸代謝能力評估的檢測方法，本發明的第二個目的是一種用于葉酸代謝能力評估的飛行質譜生物芯片，本發明的第三個目的是提供一種用于葉酸代謝能力評估的試劑盒及其使用方法。

為了實現上述的第一個目的，本發明采用了以下的技術方案：

一種用于葉酸代謝能力評估的檢測方法，該方法檢測rs1801131、rs1801133和rs1801394中至少一種，包括如下步驟：

1)以受檢者樣本DNA為模板，加入PCR擴增引物對以及單堿基延伸引物進行PCR擴增反應；

用于檢測rs1801131的PCR擴增引物的核苷酸序列如SEQ?ID?No.1、SEQ?ID?No.2所示，單堿基延伸引物核苷酸序列如SEQ?ID?No.7所示；

用于檢測rs1801133的PCR擴增引物的核苷酸序列如SEQ?ID?No.3、SEQ?ID?No.4所示，單堿基延伸引物核苷酸序列如SEQ?ID?No.8所示；

用于檢測rs1801394的PCR擴增引物的核苷酸序列如SEQ?ID?No.5、SEQ?ID?No.6所示，單堿基延伸引物核苷酸序列如SEQ?ID?No.9所示；

2)步驟1)的PCR擴增系統中加入SAP酶，消化PCR產物；

3)步驟2)的反應產物進行單堿基延伸反應；