[發(fā)明專利]一種用于葉酸代謝能力評(píng)估的飛行質(zhì)譜生物芯片及檢測(cè)方法和試劑盒

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510169415.6
• 申請(qǐng)日: 2015-04-10
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104774944A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-07-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 何文迪;宋毅;楊菲
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江博惠生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 杭州豐禾專利事務(wù)所有限公司 33214
• 代理人: 王從友

1.一種用于葉酸代謝能力評(píng)估的檢測(cè)方法，其特征在于該方法檢測(cè)rs1801131、rs1801133?和rs1801394中至少一種，包括如下步驟：

1）以受檢者樣本DNA為模板，加入PCR擴(kuò)增引物對(duì)以及單堿基延伸引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；

用于檢測(cè)rs1801131的PCR擴(kuò)增引物的核苷酸序列如SEQ?ID?No.1、SEQ?ID?No.2所示，單堿基延伸引物核苷酸序列如SEQ?ID?No.7所示；

用于檢測(cè)rs1801133的PCR擴(kuò)增引物的核苷酸序列如SEQ?ID?No.3、SEQ?ID?No.4所示，單堿基延伸引物核苷酸序列如SEQ?ID?No.8所示；

用于檢測(cè)rs1801394的PCR擴(kuò)增引物的核苷酸序列如SEQ?ID?No.5、SEQ?ID?No.6所示，單堿基延伸引物核苷酸序列如SEQ?ID?No.9所示；

2）步驟1）的PCR擴(kuò)增系統(tǒng)中加入SAP酶，消化PCR產(chǎn)物；

3）步驟2）的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)；

4）步驟3）的單堿基延伸反應(yīng)產(chǎn)物純化后與質(zhì)譜芯片共結(jié)晶，用飛行質(zhì)譜法檢測(cè)并分型，檢測(cè)目的基因的SNP位點(diǎn)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述用于葉酸代謝能力評(píng)估的檢測(cè)方法，其特征在于步驟1）中，對(duì)提取的受檢者樣本DNA進(jìn)行分光光度計(jì)定量和瓊脂糖凝膠電泳，DNA濃度>10?ng/μL，OD260/OD280>1.7，取電泳條帶明亮清晰無(wú)拖帶的樣本進(jìn)行后續(xù)操作；優(yōu)選的，步驟1）所述的PCR擴(kuò)增條件為：?93～95℃預(yù)變性1.5～2.5min；93～95℃變性25～35S，55～58℃退火25～35s，70～73℃延伸45～75s，42～48個(gè)循環(huán)；再于70～73℃繼續(xù)延伸4.5～6min；再優(yōu)選，步驟1）中，反應(yīng)體系中模板DNA的含量為1～4ng/μL，各引物的含量為80～150mM。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述用于葉酸代謝能力評(píng)估的檢測(cè)方法，其特征在于步驟2）所述的反應(yīng)條件為：36～38℃保溫35～50min，再于83～88℃反應(yīng)4.5～6min。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述用于葉酸代謝能力評(píng)估的檢測(cè)方法，其特征在于步驟3）所述的單堿基延伸反應(yīng)條件為：93～95℃預(yù)變性25～35S；延伸36～45個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)的條件為：93～95℃預(yù)變性4～7s，50～53℃退火4～7S+78～83℃延伸4～7s共4～7次；再于70～73℃繼續(xù)延伸2.5～4min。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述用于葉酸代謝能力評(píng)估的檢測(cè)方法，其特征在于步驟1）所述的PCR擴(kuò)增條件為：?94℃預(yù)變性2min；94℃變性30S，56℃退火30s，?72℃延伸1min，45個(gè)循環(huán)；再于72℃延伸5min；

步驟2）的反應(yīng)條件為：37℃保溫40min，再于85℃反應(yīng)5min；

步驟3）所述的單堿基延伸反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性30S；延伸40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)的條件為：94℃變性5s，52℃退火5S+80℃延伸5s共5次；再于72℃繼續(xù)延伸3min。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述用于葉酸代謝能力評(píng)估的檢測(cè)方法，其特征在于步驟4）中用樹(shù)脂純化延伸反應(yīng)產(chǎn)物，并且步驟4）中，利用基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時(shí)間質(zhì)譜進(jìn)行分析。

7.一種用于葉酸代謝能力評(píng)估的飛行質(zhì)譜生物芯片，其特征在于該飛行質(zhì)譜生物芯片包括樣品分析物和質(zhì)譜芯片基質(zhì)，并且樣品分析物與所述質(zhì)譜芯片基質(zhì)共結(jié)晶；

所述樣品分析物包括用于葉酸代謝能力評(píng)估的目的基因、PCR擴(kuò)增引物和單堿基延伸引物，所述目的基因?qū)?yīng)的SNP位點(diǎn)包括?rs1801131、rs1801133和rs1801394中的至少一種；

用于檢測(cè)rs1801131的PCR擴(kuò)增引物的核苷酸序列如SEQ?ID?No.1、SEQ?ID?No.2所示，單堿基延伸引物核苷酸序列如SEQ?ID?No.7所示；

用于檢測(cè)rs1801133的PCR擴(kuò)增引物的核苷酸序列如SEQ?ID?No.3、SEQ?ID?No.4所示，單堿基延伸引物核苷酸序列如SEQ?ID?No.8所示；

用于檢測(cè)rs1801394的PCR擴(kuò)增引物的核苷酸序列如SEQ?ID?No.5、SEQ?ID?No.6所示，單堿基延伸引物核苷酸序列如SEQ?ID?No.9所示。