[發(fā)明專利]一種嗜水氣單胞菌檢測方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201510150768.1 | 申請日： | 2015-04-01 |
| 公開（公告）號： | CN104730255A | 公開（公告）日： | 2015-06-24 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 林鵬;郭松林;馮建軍;盧潔;王藝?yán)?/a> | 申請（專利權(quán)）人： | 集美大學(xué) |
| 主分類號： | G01N33/68 | 分類號： | G01N33/68 |
| 代理公司： | 廈門市精誠新創(chuàng)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 35218 | 代理人： | 李伊飏 |
| 地址： | 361000 福*** | 國省代碼： | 福建;35 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 水氣 單胞菌 檢測 方法 | ||
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及微生物病原菌的檢測方法，尤其涉及一種高靈敏度的嗜水氣單胞菌檢測方法，具體為嗜水氣單胞菌的生物素-鏈霉親和素TRFIA檢測方法。
背景技術(shù)
生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)是20世紀(jì)70年代后期應(yīng)用于免疫學(xué)的一種新型生物反應(yīng)放大系統(tǒng)。生物素(Biotin)是動植物體內(nèi)廣泛分布的一種小分子生長因子，經(jīng)化學(xué)修飾后成為帶有多種活性基團(tuán)的衍生物，活化生物素可以與各種蛋白質(zhì)(如抗體、酶)結(jié)合。鏈霉親和素是由鏈霉菌(streptomyces?avidinii)分泌的一種蛋白質(zhì)，鏈霉親和素分子由4條相同的肽鏈組成，每個(gè)鏈霉親和素能結(jié)合4個(gè)分子的生物素，二者之間的親和力極強(qiáng)，比抗原與抗體間的親和力至少高1萬倍。生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)具有的多級放大獨(dú)特效應(yīng)，可極大地提高分析測定的靈敏度；二者之間的高親和、高特異結(jié)合以及既可偶聯(lián)生物大分子，又可連接標(biāo)記材料的特性，使該系統(tǒng)在標(biāo)記免疫分析技術(shù)領(lǐng)域中具有很強(qiáng)的適用性(宋耀虹,等.生物素-鏈霉親和素免疫學(xué)法測定地高辛的研究.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，1997,24:265–567)。
免疫檢測法由于操作簡單、特異性強(qiáng)而得到應(yīng)用，但酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和熒光抗體法靈敏度不高，時(shí)間分辨熒光免疫檢測(TRFIA)用長壽命的熒光物質(zhì)標(biāo)記，可有效消除背景熒光干擾，從而提高靈敏度，但由于病原菌為顆粒性抗原，會干擾熒光的測定，因此TRFIA法檢測病原菌報(bào)道不多(盧潔,等.時(shí)間分辨熒光免疫法檢測日本鰻鱺產(chǎn)酸克雷伯氏菌,分析化學(xué)，2012,40:1709-1714)，而采用生物素-鏈霉親和素的TRFIA法高靈敏檢測嗜水氣單胞菌(Aeromonas?hydrophila)從未見報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測靈敏度高，特異性強(qiáng)，穩(wěn)定性好的嗜水氣單胞菌檢測方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種嗜水氣單胞菌檢測方法，其特征在于，包括如下步驟，
1)兔抗嗜水氣單胞菌血清的制備；
2)親和純化制備兔抗IgG：采用SPA親和層析柱對兔抗嗜水氣單胞菌血清進(jìn)行純化得到兔抗IgG；
3)生物素標(biāo)記兔抗IgG的制備；
4)生物素-鏈霉親和素的TRFIA檢測；
5)根據(jù)結(jié)果判斷。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述1)為，取嗜水氣單胞菌菌株，免疫新西蘭大白兔得到兔抗嗜水氣單胞菌血清；所述嗜水氣單胞菌菌株的保藏號為CCTCC?M?2015101；
優(yōu)選的，具體步驟為，
(1)將嗜水氣單胞菌菌株接種于質(zhì)量體積比0.5％NaCl的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液中，27℃培養(yǎng)24h，用甲醛及加熱兩種方法滅活，離心，再加入無菌生理鹽水洗滌，調(diào)整細(xì)菌濃度至6.0×108cfu/mL備用；
(2)選擇2只健康的2-3kg的新西蘭大白兔，背部兩側(cè)皮下多點(diǎn)注射免疫，分4次免疫，免疫間隔期為2周，第1次免疫時(shí)與弗氏完全佐劑1∶1體積比混合、乳化，第2次免疫時(shí)與弗氏不完全佐劑1∶1體積比混合乳化，第3、4次免疫采用菌液注射，每次每只注射劑量為1mL；
(3)最后一次免疫10天后，耳靜脈采血，分離血清，用試管凝集法測定抗血清效價(jià)，效價(jià)達(dá)到1∶1280以上方可使用。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在步驟(1)中，所述離心的條件采用為4500r/min，5min。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述2)為，將1mL?SPA親和層析柱恢復(fù)室溫，用10倍柱體積的超純水洗出柱中保護(hù)液，然后用10倍柱體積的0.02mol/L?pH7.4的PBS緩沖液平衡柱子；用注射器注入所述1mL兔抗嗜水氣單胞菌血清與1mL?PBS緩沖液混勻后的混合物，孵育5min。用10倍體積的0.02mol/LpH7.4的PBS緩沖液洗脫雜蛋白，收集洗脫液。用10倍體積的0.1mol/L?pH3.0的檸檬酸鹽緩沖液洗脫兔抗嗜水氣單胞菌血清，收集樣品每管1mL，每管收集前均加入200μL?1mol/L?pH9.0的Tris-HCL緩沖液，所得即為兔抗IgG。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述3)為，親和純化后的兔抗IgG用超純水透析后，再凍干機(jī)凍干；取凍干兔抗IgG溶于PBS，取Sulfo-NHS-LC-Biotin水溶液加入所述兔抗IgG溶液中，4℃反應(yīng)；用Zeba?Desalt?Spin?Columns柱純化生物素標(biāo)記的兔抗IgG；
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