[發明專利]一種嗜水氣單胞菌檢測方法

在審

• 申請號: 201510150768.1
• 申請日: 2015-04-01
• 公開（公告）號: CN104730255A
• 公開（公告）日: 2015-06-24
• 發明（設計）人: 林鵬;郭松林;馮建軍;盧潔;王藝磊
• 申請（專利權）人: 集美大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 廈門市精誠新創知識產權代理有限公司 35218
• 代理人: 李伊飏

1.一種嗜水氣單胞菌檢測方法，其特征在于，包括如下步驟，

1)兔抗嗜水氣單胞菌血清的制備；

2)親和純化制備兔抗IgG：采用SPA親和層析柱對兔抗嗜水氣單胞菌血清進行純化得到兔抗IgG；

3)生物素標記兔抗IgG的制備；

4)生物素-鏈霉親和素的時間分辨熒光免疫檢測；

5)根據結果判斷。

2.權利要求1所述嗜水氣單胞菌檢測方法，其特征在于，所述1)為，取嗜水氣單胞菌菌株，免疫新西蘭大白兔得到兔抗嗜水氣單胞菌血清；所述嗜水氣單胞菌菌株的保藏號為CCTCC?M?2015101；

優選的，具體步驟為，

(1)將嗜水氣單胞菌菌株接種于質量體積比0.5％NaCl的牛肉膏蛋白胨培養液中，27℃培養24h，用甲醛及加熱兩種方法滅活，離心，再加入無菌生理鹽水洗滌，調整細菌濃度至6.0×10⁸cfu/mL備用；

(2)選擇2只健康的2-3kg的新西蘭大白兔，背部兩側皮下多點注射免疫，分4次免疫，免疫間隔期為2周，第1次免疫時與弗氏完全佐劑1∶1體積比混合、乳化，第2次免疫時與弗氏不完全佐劑1∶1體積比混合乳化，第3、4次免疫采用菌液注射，每次每只注射劑量為1mL；

(3)最后一次免疫10天后，耳靜脈采血，分離血清，用試管凝集法測定抗血清效價，效價達到1∶1280以上方可使用。

3.權利要求2所述嗜水氣單胞菌檢測方法，其特征在于，在步驟(1)中，所述離心的條件采用為4500r/min，5min。

4.權利要求1所述嗜水氣單胞菌檢測方法，其特征在于，所述2)為，將1mL?SPA親和層析柱恢復室溫，用10倍柱體積的超純水洗出柱中保護液，然后用10倍柱體積的0.02mol/L?pH7.4的PBS緩沖液平衡柱子；用注射器注入所述1mL兔抗嗜水氣單胞菌血清與1mLPBS緩沖液混勻后的混合物，孵育5min。用10倍體積的0.02mol/LpH7.4的PBS緩沖液洗脫雜蛋白，收集洗脫液。用10倍體積的0.1mol/L?pH3.0的檸檬酸鹽緩沖液洗脫兔抗嗜水氣單胞菌血清，收集樣品每管1mL，每管收集前均加入200μL?1mol/L?pH9.0的Tris-HCL緩沖液，所得即為兔抗IgG。

5.權利要求1所述嗜水氣單胞菌檢測方法，其特征在于，所述3)為，親和純化后的兔抗IgG用超純水透析后，再凍干機凍干；取凍干兔抗IgG溶于PBS，取Sulfo-NHS-LC-Biotin水溶液加入所述兔抗IgG溶液中，4℃反應；用Zeba?Desalt?Spin?Columns柱純化生物素標記的兔抗IgG；

優選的，所述3)為，用超純水4℃透析親和純化后的兔抗IgG?24h，其間換透析液兩次，凍干機凍干；取2mg凍干兔抗IgG溶于1mL?0.15mol/L?pH?7.2的PBS；稱取2.2mg?Sulfo-NHS-LC-Biotin溶于400μL超純水中，取其中的26.9μL加于兔抗IgG溶液中，4℃反應2h；用Zeba?Desalt?Spin?Columns柱純化生物素標記的兔抗IgG。

6.權利要求5所述嗜水氣單胞菌檢測方法，其特征在于，所得到的生物素標記兔抗IgG中，Sulfo-NHS-LC-Biotin和IgG的分子數之比為2.87。

7.權利要求1所述嗜水氣單胞菌檢測方法，其特征在于，還包括在3)之前進行抗嗜水氣單胞菌IgG的純度鑒定步驟。