[發(fā)明專利]一種分離DNA結(jié)合蛋白并精確定位其DNA結(jié)合位點的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201510147863.6
• 申請日: 2015-03-31
• 公開（公告）號: CN104725465A
• 公開（公告）日: 2015-06-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王友信;王嵬
• 申請（專利權(quán)）人: 首都醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號: C07K1/14
• 分類號: C07K1/14;C12Q1/68
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及DNA結(jié)合蛋白，具體地說，涉及一種分離DNA結(jié)合蛋白并精確定位其DNA結(jié)合位點的方法。

背景技術(shù)

目前對啟動子DNA結(jié)合蛋白的研究方法可分為兩大類。第一類是細胞內(nèi)方法，以已知的啟動子DNA序列篩選與其相結(jié)合的蛋白編碼基因，通過生物信息學(xué)分析來確定該蛋白質(zhì)，如酵母單雜交系統(tǒng)(yeast?one?hybrid?system，Y1H)、噬菌體展示技術(shù)(phage?display，PD)等。第二類是細胞外法，即在體外用重組的已知蛋白質(zhì)與啟動子DNA結(jié)合，如凝膠阻滯實驗、DNase?I足跡試驗等。

細胞內(nèi)方法由于是細胞內(nèi)篩選，符合生理狀態(tài)，適合高通量篩選用于尋找未知基因及蛋白質(zhì)，但是只能篩選可與啟動子DNA特異性結(jié)合的蛋白，但不能檢查出精確的蛋白質(zhì)結(jié)合位點，而且其特異性需要進一步驗證。細胞外法可以查出精確的蛋白質(zhì)結(jié)合位點，但效率低下、操作復(fù)雜，一般不用于尋找未知基因及蛋白質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種可以尋找潛在DNA結(jié)合蛋白并且可以對其與DNA結(jié)合位點進行精確定位的方法。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種分離DNA結(jié)合蛋白并精確定位其DNA結(jié)合位點的方法，

分離DNA結(jié)合蛋白：通過利用帶有生物素標記的引物PCR擴增待研究DNA片段，先后加入核蛋白或胞質(zhì)蛋白和親和素包被的磁珠，共同孵育，洗去非特異結(jié)合的蛋白，加入SDS使蛋白質(zhì)變性釋放，鑒定蛋白質(zhì)；

這樣擴增的每個PCR片段末端都帶有一個生物素基團，生物素與親和素包被磁珠(Streptavidin?Sepharose)結(jié)合，而親和素包被磁珠又可以與帶吸力真空準備工具(vacuum?prep?tool)結(jié)合，從而被分離出來。

定位蛋白質(zhì)的DNA結(jié)合位點：以待研究的DNA片段為模板，采用不同的引物通過PCR反應(yīng)獲得相互重疊的DNA片斷，根據(jù)相互重疊的DNA片斷對結(jié)合蛋白親和力的差異定位結(jié)合蛋白的DNA結(jié)合位點。

進一步地，所述方法具體包括如下步驟：

S1：DNA片段的擴增：

以待研究的DNA片段為模板，利用帶有生物素標記的引物通過PCR反應(yīng)進行擴增；經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，切下帶有目的片斷的凝膠回收純化，獲得純的DNA片斷(0.5-3.0ug)；

S2：蛋白質(zhì)的分離：

PCR產(chǎn)物中加入核蛋白或胞質(zhì)蛋白，共同孵育；

加入親和素包被的磁珠，共同孵育；

緩沖液洗去非特異結(jié)合的蛋白；

加入SDS使蛋白質(zhì)變性釋放，鑒定蛋白質(zhì)；

S3：定位蛋白質(zhì)的DNA結(jié)合位點：

以待研究的DNA片段為模板，采用不同的引物通過PCR反應(yīng)獲得相互重疊的DNA片斷；

根據(jù)上述相互重疊的DNA片斷對結(jié)合蛋白親和力的差異定位結(jié)合蛋白的DNA結(jié)合位點。

更進一步地，所述待研究的DNA片段為200-300bp。

所述步驟S1中任意一條引物的5’末端采用生物素標記。

進一步地，所述步驟S2具體為：

1)在96孔板中預(yù)先加入30μL?ddH₂O；

2)100μL?PCR產(chǎn)物中加入50μL核蛋白或胞質(zhì)蛋白，37℃孵育15分鐘；

3)Streptavidin?Sepharose^TM?HP(鏈霉親和素瓊脂糖凝膠)混勻，取6μL加入到46μL?binding?buffer(結(jié)和緩沖液)，以吸頭混勻5分鐘，混合物加入到含有PCR產(chǎn)物-蛋白混合物的96孔PCR反應(yīng)板；

4)在Vacuum?prep?workstation(真空準備工作站)中，四個樣品板中依次加入180ml高純水、Denaturation?buffer(變性緩沖液)、washing?buffer(清洗緩沖液)和PBS(磷酸緩沖液)；

5)打開vacuum?prep?workstation(真空準備工作站)的抽氣泵，將vacuum?prep?tool(真空準備工具)在高純水中清洗30秒；

6)將vacuum?prep?tool(真空準備工具)移到PCR板中，抓取親和素包被磁珠-生物素-DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物；

7)將vacuum?prep?tool(真空準備工具)在Denaturation?buffer(變性緩沖液)、washing?buffer(清洗緩沖液)或PBS(磷酸緩沖液)中洗滌15秒；