[發明專利]一種分離DNA結合蛋白并精確定位其DNA結合位點的方法

在審

• 申請號: 201510147863.6
• 申請日: 2015-03-31
• 公開（公告）號: CN104725465A
• 公開（公告）日: 2015-06-24
• 發明（設計）人: 王友信;王嵬
• 申請（專利權）人: 首都醫科大學
• 主分類號: C07K1/14
• 分類號: C07K1/14;C12Q1/68
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

1.一種分離DNA結合蛋白并精確定位其DNA結合位點的方法，其特征在于，分離DNA結合蛋白：通過利用帶有生物素標記的引物PCR擴增待研究DNA片段，先后加入核蛋白或胞質蛋白和親和素包被的磁珠，共同孵育，洗去非特異結合的蛋白，加入SDS使蛋白質變性釋放，鑒定蛋白質；定位蛋白質的DNA結合位點：以待研究的DNA片段為模板，采用不同的引物通過PCR反應獲得相互重疊的DNA片斷，根據相互重疊的DNA片斷對結合蛋白親和力的差異定位結合蛋白的DNA結合位點。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具體包括如下步驟：

S1：DNA片段的擴增：

以待研究的DNA片段為模板，利用帶有生物素標記的引物通過PCR反應進行擴增；

S2：蛋白質的分離：

PCR產物中加入核蛋白或胞質蛋白，共同孵育；

加入親和素包被的磁珠，共同孵育；

緩沖液洗去非特異結合的蛋白；

加入SDS使蛋白質變性釋放，鑒定蛋白質；

S3：定位蛋白質的DNA結合位點：

以待研究的DNA片段為模板，采用不同的引物通過PCR反應獲得相互重疊的DNA片斷；

根據上述相互重疊的DNA片斷對結合蛋白親和力的差異定位結合蛋白的DNA結合位點。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述待研究的DNA片段為200-300bp。

4.根據權利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述步驟S1中任意一條引物的5’末端采用生物素標記。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述步驟S2具體為：

1)在96孔板中預先加入30μL高純水；

2)100μL?PCR產物中加入50μL核蛋白或胞質蛋白，37℃孵育15分鐘；

3)Streptavidin?Sepharose^TM?HP(鏈霉親和素瓊脂糖凝膠)混勻，取6μL加入到46μL?binding?buffer(結和緩沖液)，以吸頭混勻5分鐘，混合物加入到含有PCR產物-蛋白混合物的96孔PCR反應板；

4)在Vacuum?prep?workstation(真空準備工作站)中，四個樣品板中依次加入180ml高純水、Denaturation?buffer(變性緩沖液)、washing?buffer(清洗緩沖液)和PBS(磷酸緩沖液)；

5)打開vacuum?prep?workstation(真空準備工作站)的抽氣泵，將vacuum?prep?tool(真空準備工具)在高純水中清洗30秒；

6)將vacuum?prep?tool(真空準備工具)移到PCR板中，抓取親和素包被磁珠-生物素-DNA-蛋白質復合物；

7)將vacuum?prep?tool(真空準備工具)在Denaturation?buffer(變性緩沖液)、washing?buffer(清洗緩沖液)或PBS(磷酸緩沖液)中洗滌15秒；

8)關掉抽氣泵，將vacuum?prep?tool(真空準備工具)放入含有超純水的96孔板中，搖動，釋放混合物；

9)吸取混合物，放入離心管中，-20℃保存；

10)DNA結合蛋白的鑒定。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，DNA結合蛋白通過SDS-PAGE、凝膠阻滯實驗室或色譜法鑒定。