[發明專利]一種耐酸耐鹽兼性厭氧芽孢桿菌的制備方法

在審

• 申請號: 201510120005.2
• 申請日: 2015-03-18
• 公開（公告）號: CN104762295A
• 公開（公告）日: 2015-07-08
• 發明（設計）人: 劉玉婷;潘進權;何華美;劉夏婷;李淑珍;鄧艷梨;陳超才
• 申請（專利權）人: 嶺南師范學院
• 主分類號: C12N15/08
• 分類號: C12N15/08;C12R1/125;C12R1/225
• 代理公司: 四川君士達律師事務所 51216
• 代理人: 芶忠義

技術領域

本發明涉及一種原生質融合技術，具體涉及一種耐酸耐鹽兼性厭氧芽孢桿菌的制備方法。

背景技術

當前，我國的養殖行業正在經歷轉型升級，傳統的中小規模飼養的農業養殖模式正在逐步向集約化規模化的工業養殖模式過渡。伴隨著養殖模式的轉變，暴露出一些亟待解決的關鍵問題。集約化養殖的飼養環境相對密封，養殖密度大，動物免疫能力和抗疾病能力減弱，對此，養殖中抗生素的使用就凸顯出來。飼養過程中抗生素大量添加又導致了動物胃腸道的正常菌群失調、內源性感染或二重感染，產生耐藥菌株等弊端，特別是產品中的抗生素殘留會通過食物鏈影響人類的健康，引發了一系列的公共安全問題、環境保護問題、畜禽產品質量等問題。由于抗生素的藥物殘留問題，我國動物養殖產品出口受到很大影響。隨著社會經濟的發展及國家無公害食品行動計劃的實施，人們食品安全意識日趨增強，越來越關注健康和產品質量，無公害食品、綠色食品消費在世界范圍內已成為潮流。養殖生產將經歷著由數量型向質量型的巨大歷史變革。

國內外的研究表明乳酸菌等能產生乳酸、乙酸及次級代謝產物，在動物體內調節胃腸道菌群平衡，使有益微生物的數量增加，增強了動物非特異性免疫系統功能；芽孢桿菌屬微生物由于具有較強的抗逆特性、能分泌高活性的脂肪酶、蛋白酶及淀粉酶等消化酶，以上特性可以提高飼料的轉化率和防病、促進動物對營養物質的消化吸收以及促進動物的生長性能及較好的益生效果。因此，以乳酸菌、芽孢桿菌等為代表的飼用微生物在養殖業中得到了大量的應用，成為了帶到養殖業轉型升級的重要推動力。

目前，在養殖領域中使用的微生物主要包括兩個類型，一類是厭氧型的乳酸菌，另一類是好氧型的芽孢桿菌。這兩類微生物在使用效果上各有其優缺點：乳酸菌可以在動物腸道的缺氧環節中正常生長而發揮益生效果，但是該菌的耐熱效果較差，耐酸耐鹽能力也有限；芽孢桿菌具有分泌多種消化酶的能力，而且具有較強的抗逆性，但是不能在厭氧環節中生長，因此對動物腸道的益生效果有限。

因此，急需發明一種新型的集乳酸菌與芽孢桿菌益生優勢于一體的飼用微生物以使其益生效果最大化，解決飼用微生物在使用中存在的問題。

發明內容

本發明針對自然界中具有兼性厭氧特性并適用于動物飼養的微生物群體較少，若直接從自然環境中分離具有兼性厭氧特性的飼用芽孢桿菌，成功率極低的缺陷，目的在于提供一種耐酸耐鹽兼性厭氧芽孢桿菌的制備方法。

本發明具體通過以下技術方案實現：

一種耐酸耐鹽兼性厭氧芽孢桿菌的制備方法，具體包括以下步驟：

1)原生質體的制備：乳酸桿菌原生質體制備條件為：取活化培養12h的乳酸桿菌細胞，加入濃度為3.5mg/mL的溶菌酶，在pH7.0、溫度37℃的條件下酶解45min；芽孢桿菌原生質體制備條件為：取活化培養6h的芽孢桿菌細胞，加入濃度為2.0mg/mL的溶菌酶，在pH7.0、溫度37℃的條件下酶解30min。

2)將乳酸桿菌原生質體和芽孢桿菌原生質體分別進行滅活；

3)滅活后的乳酸桿菌與芽孢桿菌原生質體的融合。

所述的乳酸桿菌為篩選得到的耐酸耐鹽乳酸桿菌；所述的芽孢桿菌為篩選得到的產蛋白酶耐酸耐鹽芽孢桿菌。

所述的活化培養采用的活化培養基為：

乳酸桿菌：蛋牛肉膏10.0g，葡萄糖20.0g，白胨10.0g，酵母膏5.0g，吐溫-801.0mL，K₂PHO₄2.0g，乙酸鈉5.0g，檸檬酸三銨2.0g，MgSO₄·7H₂O?0.2g，MnSO₄·H₂O?0.05g，蒸餾水定容至1L，pH?6.5，121℃滅菌20min。

芽孢桿菌：牛肉膏5.0g，葡萄糖10.0g，蛋白胨10.0g，酵母膏5.0g，NaCl?5.0g，蒸餾水定容至1L，pH?7.2，121℃滅菌20min。

所述的溶解酶用SMM配制，再用孔徑為0.22μm的無菌濾器過濾除菌，分裝成單次使用的小份，-20℃保存。

所述的滅活條件為：乳酸桿菌原生質體：65℃熱處理120min；芽孢桿菌原生質體：30W紫外燈20cm處照射15min。

所述的融合條件為選用濃度為40％pH7.0融合劑，在35～40℃條件下融合20～30min。