[發(fā)明專利]一種耐酸耐鹽兼性厭氧芽孢桿菌的制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510120005.2
• 申請日: 2015-03-18
• 公開（公告）號: CN104762295A
• 公開（公告）日: 2015-07-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉玉婷;潘進(jìn)權(quán);何華美;劉夏婷;李淑珍;鄧艷梨;陳超才
• 申請（專利權(quán)）人: 嶺南師范學(xué)院
• 主分類號: C12N15/08
• 分類號: C12N15/08;C12R1/125;C12R1/225
• 代理公司: 四川君士達(dá)律師事務(wù)所 51216
• 代理人: 芶忠義

1.一種耐酸耐鹽兼性厭氧芽孢桿菌的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：

1)原生質(zhì)體的制備：

耐酸耐鹽乳酸桿菌原生質(zhì)體制備條件為：取活化培養(yǎng)12h的乳酸桿菌細(xì)胞，加入濃度為3.5mg/mL的溶菌酶，在pH7.0、溫度37℃的條件下酶解45min；

產(chǎn)蛋白酶耐酸耐鹽芽孢桿菌原生質(zhì)體制備條件為：取活化培養(yǎng)6h的芽孢桿菌細(xì)胞，加入濃度為2.0mg/mL的溶菌酶，在pH7.0、溫度37℃的條件下酶解30min；

2)將乳酸桿菌原生質(zhì)體和芽孢桿菌原生質(zhì)體分別進(jìn)行滅活；

3)滅活后的乳酸桿菌與芽孢桿菌原生質(zhì)體利用融合劑進(jìn)行融合。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種耐酸耐鹽兼性厭氧芽孢桿菌的制備方法，其特征在于：所述的活化培養(yǎng)采用的活化培養(yǎng)基為：

乳酸桿菌：蛋牛肉膏10.0g，葡萄糖20.0g，白胨10.0g，酵母膏5.0g，吐溫-801.0mL，K₂PHO₄?2.0g，乙酸鈉5.0g，檸檬酸三銨2.0g，MgSO₄·7H₂O?0.2g，MnSO₄·H₂O?0.05g，蒸餾水定容至1L，pH?6.5，121℃滅菌20min；

芽孢桿菌：牛肉膏5.0g，葡萄糖10.0g，蛋白胨10.0g，酵母膏5.0g，NaCl?5.0g，蒸餾水定容至1L，pH?7.2，121℃滅菌20min。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種耐酸耐鹽兼性厭氧芽孢桿菌的制備方法，其特征在于：所述的溶解酶為用SMM配制，再用孔徑為0.22μm的無菌濾器過濾除菌，分裝成單次使用的小份，-20℃保存。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種耐酸耐鹽兼性厭氧芽孢桿菌的制備方法，其特征在于：所述的滅活條件為：乳酸桿菌原生質(zhì)體：65℃熱處理120min；芽孢桿菌原生質(zhì)體：30W紫外燈20cm處照射15min。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種耐酸耐鹽兼性厭氧芽孢桿菌的制備方法，其特征在于：所述的融合條件為選用濃度為40％pH7.0融合劑，在35～40℃條件下融合20～30min。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種耐酸耐鹽兼性厭氧芽孢桿菌的制備方法，其特征在于：所述的融合劑的制備方法為：40g?PEG，KH₂PO₄0.27g，CaCl₂?0.11g，用pH7.0的PBS緩沖液定容到100mL，121℃滅菌20min，備用。