[發明專利]一種利用海藻酸鈣小球調節細菌纖維素結構的方法

在審

• 申請號: 201510116588.1
• 申請日: 2015-03-17
• 公開（公告）號: CN104711302A
• 公開（公告）日: 2015-06-17
• 發明（設計）人: 張衡;朱春林;楊加志;陳春濤;黃洋
• 申請（專利權）人: 南京榮之盛生物科技有限公司
• 主分類號: C12P19/04
• 分類號: C12P19/04;C12R1/02
• 代理公司: 南京理工大學專利中心 32203
• 代理人: 鄒偉紅;朱顯國

技術領域

本發明涉及一種利用海藻酸鈣小球調節細菌纖維素結構的方法，屬于生物材料制備領域。

背景技術

細菌纖維素（Bacterial?cellulose，簡稱BC）是由多種微生物分泌合成的一種胞外多糖，靜置條件下培養，會在培養液-空氣表面形成一種水凝膠膜。BC與植物纖維素（Plant?cellulose，簡稱PC）具有相同的化學組成成分，但相比于PC，BC具有一些優越的性能，如拉伸強度高，純度高，生物相容性好，且具有三維納米網絡結構。

基于BC的優良性能，BC已作為再生組織用于人造皮膚、血管移植等。但BC的纖維網絡尺寸過小，使哺乳動物細胞在培養過程中不能滲透生長進入BC內部，限制了BC在組織工程材料上的應用。目前已發展多種提高細胞孔隙率，改變細胞空洞結構的方法，多種文獻均有報道（¹Baah-Dwomoh?A,?Rolong?A,?Gatenholm?P,?et?al.?The?feasibility?of?using?irreversible?electroporation?to?introduce?pores?in?bacterial?cellulose?scaffolds?for?tissue?engineering.?Appl?Microbial?Biotechnol,?2015:1-10.?²Yin?N,?Stilwell?M?D,?Santos?T?M?A,?et?al.?Agarose?particle-templated?porous?bacterial?cellulose?and?its?application?in?cartilage?growth?in?vitro.?Acta?biomaterialia,?2015,?12:129-138.?³?Andersson?J,?Stenhamre?H,?B?ckdahl?H,?Gatenholm?P.?Behavior?of?human?chondrocytes?in?engineered?porous?bacterial?cellulose?scaffolds.?Journal?of?Biomedical?Materials?Research?Part?A,?2010,?94A:1124–1132.），如發酵過程中摻入石蠟小球、淀粉顆粒及瓊脂小球等，但這些方法都存在一定的缺陷，如石蠟不易除去，反復處理會對已形成的孔洞結構造成破壞，淀粉顆粒會發生沉淀，制孔效果不明顯，瓊脂小球不易滅菌，BC培養過程存在染菌風險。

發明內容

本發明的目的是提供一種有效調節細菌纖維素三維結構的方法。

本發明的原理是：木醋桿菌（Acetobacter?xylinum?RZS.1，簡稱A.?xy?RZS.1）是一種嚴格好氧菌，是BC生產的模式菌株。本發明中使用A.?xy?RZS.1，通過靜態培養，獲得正在生長的BC膜，向BC膜上鋪撒海藻酸鈣小球，利用A.?xy?RZS.1的好氧性及對營養的趨向性，細胞會穿過海藻酸鈣小球向空氣界面滲透移動，在隨后合成BC的過程中，會將海藻酸鈣小球包裹進纖維素網絡結構中。由于通過靜電紡絲條件的改變，調節海藻酸鈣小球的大小，且獲得的小球尺寸均一，這樣可以制備不同孔徑結構的BC。海藻酸鈣小球是由鈣離子交聯的多糖，易于去除，在后處理的過程中不會對已調節形成的三維結構造成明顯的影響。

實現本發明目的的技術解決方案為：一種利用海藻酸鈣小球調節細菌纖維素結構的方法，包括如下步驟：

第一步：分別配制5-30?g/L的海藻酸鈉溶液和10-100?g/L氯化鈣溶液（氯化鈣用作交聯劑），控制流速5-20?ml/h、電壓4-20?kV，采用靜電紡絲技術制備海藻酸鈣小球，將小球固定化2-36?h后，115-121℃滅菌15-30?min，冷卻至室溫，備用；

第二步：木醋桿菌進行種子擴增培養；

第三步：制備發酵液；

第四步：接種后，在25-32℃條件下進行靜態培養，靜態培養1-5天后，在已形成的細菌纖維素凝膠表面均勻鋪撒上海藻酸鈣小球，繼續靜態培養；

第五步：靜態培養結束后，取出上層膜，用0.1-1mol/L?EDTA溶液溶解海藻酸鈣小球；

第六步：去除殘留的細胞及發酵液，用去離子水沖洗BC膜至中性。