[發明專利]利用Runx2和小分子化合物誘導人成纖維細胞重編程為成骨細胞的方法

有效

• 申請號: 201510099327.3
• 申請日: 2015-03-06
• 公開（公告）號: CN104762324B
• 公開（公告）日: 2017-12-15
• 發明（設計）人: 胡敏;李燕皎
• 申請（專利權）人: 昆明學院
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/12;C12N5/10;C12N5/077
• 代理公司: 昆明今威專利商標代理有限公司53115
• 代理人: 賽曉剛

技術領域

本發明涉及一種利用Runx2和小分子化合物誘導人成纖維細胞重編程成骨細胞的方法，特別是一種利用Runx2基因表達及小分子化合物CHIR99021和/或小分子化合物forskolin，在地塞米松存在的條件下誘導人成纖維細胞轉分化為成骨細胞的方法，屬細胞生物學與組織工程領域。

背景技術

骨組織工程技術通過把成骨細胞和/或能引導骨組織再生的生物活性因子整合植入特殊的支架結構中以作為組織工程復合骨，希望替代傳統的移植材料和技術。因此，骨組織工程需要大量種子細胞和專門的支架材料以支持細胞黏附和分化。傳統應用的種子細胞包括分化晚期的成骨細胞、成骨細胞株、骨髓混合細胞或純化的間充質干細胞。但此類細胞的來源有限、獲取過程復雜并伴隨供體較重的傷害，因而廣泛應用受到限制。

與骨髓來源細胞相比，非成骨細胞如皮膚成纖維細胞來源豐富、很容易從患者獲取并進行體外長期大量擴增培養。現在利用細胞轉分化技術已經可以使皮膚成纖維細胞直接轉變成成肌細胞、神經元、肝細胞、成骨細胞等多種不同類型的功能細胞，或先轉變成多能干細胞再進一步定向分化成神經細胞或各種不同類型的功能性體細胞。引人注目的是，這些從皮膚細胞直接或間接轉分化而得到的功能性神經細胞或體細胞已經不再保持原來母細胞的基因表達譜等分子與細胞特性，卻獲得了各種目的細胞的典型特征與功能。另外這些誘導性功能細胞不僅可以用來模擬相關的疾病，有的還成功地通過移植到疾病動物模型達到治療目的。

為了實現高效、快速、特異性的細胞轉分化，一般需要經過系統、廣泛的篩選確定特異的轉錄因子等基因組合，在特定情況下人細胞可能比動物細胞轉分化所需要的基因組合會復雜一些，有的轉錄因子還需要相應的信號分子協同作用才能實現轉分化作用，比如我們發現了NGN2介導的人皮膚細胞轉分化到神經細胞就必須有兩種小分子化合物的協同作用。目前已有報道的成骨細胞轉分化因子如BMP-2, BMP-7，LMP3單獨或協同作用可以使皮膚成纖維細胞轉分化為在體外、體內都具有骨形成作用的成骨細胞。這幾種基因表達產物為分泌性的蛋白質，其表達分泌調控復雜。由于它們能通過旁分泌作用于周圍的非骨質組織引起異位骨形成，在轉分化細胞中長期持續高表達可能導致對移植部位周圍健康組織的副作用。

2006年，ANDRE′ S J. GARCI′A報道，通過使用對成骨細胞起決定性作用的關鍵轉錄因子，如在骨組織細胞特異性表達的轉錄因子Runx2，在單獨用于轉分化時沒有效果，在有激素信號分子地塞米松的協同作用使大鼠的皮膚成纖維細胞轉分化為成骨細胞。2013年鄧宏魁報道，通過篩選了10000種小分子化合物后，找到4種小分子，可以實現皮膚成纖維細胞的重編程，其中CHIR99021和Forskolin在重編程過程中發揮了重要的作用。

此外，化學小分子誘導細胞重新編程轉變特定類型的細胞有其獨特優勢：①誘導過程短，藥物可高效到達靶細胞；②可控性，可以準確控制藥物達到需要的濃度；③成本低，化學小分子一旦確定可以大規模生產。

發明內容

本發明目的在于克服上述現有技術存在的不足，提出一種利用必需的基因/小分子組合（Runx2/CHIR99021和Forskolin），在細胞表達Runx2 的基礎上，用一定比例的小分子CHIR99021和Forskolin組合，誘導人皮膚成纖維細胞向成骨細胞分化。

本發明的另一個目的是提供一種用于預防或治療與成骨細胞分化相關的疾病的藥物組合物，前期在高濃度9μm的CHIR99021和10μmForskolin的組合，保持外源導入的Runx2持續一定時間的表達，在地塞米松的協同作用下，向成骨細胞方向誘導。

本發明采用以下技術方案完成本發明目的：一種利用Runx 2和小分子化合物誘導人成纖維細胞重編程為成骨細胞的方法，其特征是利用Runx2基因的表達及小分子化合物CHIR99021和forskolin，誘導人成纖維細胞轉分化為成骨細胞。

先構建攜帶 Runx2-GFP的慢病毒浸染人皮膚成纖維細胞，使正常人皮膚成纖維細胞表達 Runx2，放置普通培養液培養3～7天后，在該普通培養液再加入小分子化合物6μM～12μM的forskolin + 5～15nM的地塞米松兩種物質，組成激素信號分子誘導液，在該激素信號分子誘導液中再進行7～15天的細胞培養，隨后利用成骨細胞分化液進行誘導（37°C， 5%CO₂），5～7天后可誘導為成骨細胞；