[發(fā)明專利]利用Runx2和小分子化合物誘導(dǎo)人成纖維細(xì)胞重編程為成骨細(xì)胞的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510099327.3
• 申請日: 2015-03-06
• 公開（公告）號: CN104762324B
• 公開（公告）日: 2017-12-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 胡敏;李燕皎
• 申請（專利權(quán)）人: 昆明學(xué)院
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/12;C12N5/10;C12N5/077
• 代理公司: 昆明今威專利商標(biāo)代理有限公司53115
• 代理人: 賽曉剛

1.一種利用Runx2和小分子化合物誘導(dǎo)人成纖維細(xì)胞重編程為成骨細(xì)胞的方法，其特征是：利用Runx2基因的表達(dá)及小分子化合物誘導(dǎo)人成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為成骨細(xì)胞；所述小分子化合物為forskolin，或CHIR99021和forskolin的混合物；

所述方法先構(gòu)建攜帶 Runx2-GFP的慢病毒浸染人皮膚成纖維細(xì)胞，使正常人皮膚成纖維細(xì)胞表達(dá) Runx2，將病毒浸染后的皮膚成纖維細(xì)胞放置在普通培養(yǎng)液中培養(yǎng)3～7天后，更換為激素信號分子誘導(dǎo)液再培養(yǎng)7～15天，隨后利用成骨細(xì)胞分化液進(jìn)行誘導(dǎo)，5～7天后可誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞；所述激素信號分子誘導(dǎo)液是在普通培養(yǎng)液中加入6μM～12μM的小分子化合物forskolin + 5～15nM的地塞米松兩種物質(zhì)或者加入5～10μM 小分子化合物CHIR99021+ 6μM～12μM小分子化合物forskolin+ 5～15nM地塞米松三種物質(zhì)組成的。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用Runx2和小分子化合物誘導(dǎo)人成纖維細(xì)胞重編程為成骨細(xì)胞的方法，其特征是：所述普通培養(yǎng)液配方是：10％胎牛血清 + 100U/mL青霉素 + 100μg/mL鏈霉素 + 高糖DMDM培養(yǎng)基，在37℃，5%CO₂環(huán)境下培養(yǎng)細(xì)胞；

所述成骨細(xì)胞分化液配方是：10％胎牛血清Hyclone + 100U/mL青霉素Sigma+ 100μg/mL鏈霉素Sigma+ 高糖DMDM培養(yǎng)基Gibco+ 10mM β-甘油磷酸 + 100nM地塞米松 + 0.2mM ascorbate-2-phosphate ；在37℃，5%CO₂ 環(huán)境下培養(yǎng)細(xì)胞。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用Runx2和小分子化合物誘導(dǎo)人成纖維細(xì)胞重編程為成骨細(xì)胞的方法，其特征是：所述激素信號分子誘導(dǎo)液中包括9μM小分子化合物CHIR99021+10μM小分子化合物forskolin+10nM地塞米松。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用Runx2和小分子化合物誘導(dǎo)人成纖維細(xì)胞重編程為成骨細(xì)胞的方法，其特征是：所述方法的詳細(xì)步驟如下：

（一）、質(zhì)粒構(gòu)建和細(xì)胞培養(yǎng)

1.1細(xì)胞培養(yǎng)

先采集普通人皮膚成纖維細(xì)胞，將人皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)于由10％胎牛血清Hyclone + 100U/mL 青霉素Sigma + 100μg/mL 鏈霉素Sigma+ 高糖DMDM組成的普通培養(yǎng)液Gibco中，并貼壁于包被有明膠的6 孔板中；接種細(xì)胞密度5～6×10³/cm²，培養(yǎng)于37℃，5％ CO₂的培養(yǎng)箱中；

1.2質(zhì)粒構(gòu)建

將來源于人類的全長Runx2 的cDNA插入到含GFP的pVSVG載體中，另外還構(gòu)建僅含有GFP的pVSVG的空載；

（二）、病毒侵染細(xì)胞

慢病毒包裝與感染：目的基因Runx2質(zhì)粒與病毒包裝質(zhì)粒通過Lipofectamine 2000共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，獲得了高滴度的病毒，分別對普通的人皮膚成纖維細(xì)胞感染Runx2-GFP-PVSVG慢病毒和GFP-PVSVG空載的慢病毒，感染效率分別可達(dá)到61%和93.4%；

（三）、小分子誘導(dǎo)

將病毒感染后的皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)3～７天，使用普通培養(yǎng)液培養(yǎng)，配方是：10％胎牛血清Hyclone+ 100U/mL青霉素Sigma + 100μg/mL鏈霉素Sigma+ 高糖DMDM培養(yǎng)基Gibco；

之后更換為在普通培養(yǎng)液添加有小分子化合物后組成的激素信號分子誘導(dǎo)液再培養(yǎng)７～15天，激素信號分子誘導(dǎo)液的配方是：10％胎牛血清Hyclone+ 100U/mL青霉素Sigma+ 100μg/mL鏈霉素Sigma+ 高糖DMDM培養(yǎng)基Gibco + 5～10μM的CHIR99021 + 6μM～12μM Forskolin + 10nM地塞米松；

（四）、成骨細(xì)胞分化液

隨后再更換為成骨細(xì)胞分化液進(jìn)行培養(yǎng)，成骨細(xì)胞分化液的配方是：10％胎牛血清Hyclone+ 100U/mL青霉素Sigma + 100μg/mL鏈霉素Sigma+ 高糖DMDM培養(yǎng)基Gibco+ 10mM β甘油磷酸 + 100nM地塞米松+ 0.2mM ascorbate-2-phosphate，此后，每隔2～3天更換一次成骨細(xì)胞分化液，持續(xù)誘導(dǎo)5天以上;其后的細(xì)胞培養(yǎng)，一直使用成骨細(xì)胞分化液維持；

（五）、茜素紅染色鑒定

① 將舊的誘導(dǎo)液吸除，將誘導(dǎo)后的細(xì)胞暴露，利用PBS 清洗細(xì)胞3 次；

② 取含4％多聚甲醛的固定液固定細(xì)胞30min；

③ 去固定液，利用2％的茜素紅染液，37℃，孵育30min，放在培養(yǎng)箱中進(jìn)行；

④ 棄去茜素紅染色液，利用超純水清洗3 次以上，以避免出現(xiàn)假陽性；

⑤ 在倒置顯微鏡下拍照實驗組和對照組。