[發明專利]一種重組稀有鮈鯽雌激素受體雙雜交酵母gERβ1-GRIP1及其應用

在審

• 申請號: 201510098247.6
• 申請日: 2015-03-05
• 公開（公告）號: CN104711204A
• 公開（公告）日: 2015-06-17
• 發明（設計）人: 王子健;楊明嘉;韋玉梅;馬梅
• 申請（專利權）人: 中國科學院生態環境研究中心
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;G01N33/68
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;陳曉慶

技術領域

本發明涉及一種重組稀有鮈鯽雌激素受體雙雜交酵母gERβ1-GRIP1及其應用，屬于生物技術領域。

背景技術

環境中的內分泌干擾物，亦被稱為環境激素，是指能夠影響動物的內分泌系統機能，對個體及其后代或者群體(部分亞群體)造成損害的外源性化學物質或混合物。美國環境保護局(EPA)描述了其影響內分泌系統的具體過程：對生物的正常行為及生殖、發育相關的正常激素的合成、貯存、分泌、體內輸送、結合及清除等過程產生妨礙作用。環境中的內分泌干擾物的干擾效應包括：雌激素干擾效應、雄激素干擾效應、甲狀腺激素干擾效應等，特別是雌激素干擾效應能夠對生物及人類生殖系統造成嚴重影響。盡管具有雌激素干擾活性的化合物在環境中濃度極小，但是其一旦進入人體和動物體內，可以與特定的雌激素受體(ER)結合形成復合物，該復合物進一步與細胞核內的雌激素反應元件(ERE)結合，啟動特定基因的表達，產生相應的生理生化效應，干擾內分泌系統的正常功能。

20世紀90年代對雌激素受體作用機制的研究進一步發現了雌激素受體的共激活因子(co?activator)(Hong,H.,Kohlit,K.,Trivedit,A.,Deborah,L.,Johnson,D.L.和Stallcup,M.R.,1996,Natl.Acad.Sci.USA.93:4948-4952)。雌激素(或者環境中類雌激素物質)與相應雌激素受體的配體結合區(LBD)結合后形成復合物并引起構象改變，進一步結合受體共激活因子，促進下游基因的轉錄。

通常采用化學分析和生物測試技術對環境中雌激素干擾效應進行研究?；瘜W分析法需要高分辨色譜/高分辨質譜，除了分析費用高外，對儀器設備條件和人員素質有相當嚴格的要求。生物測試技術中重組雌激素受體基因雙雜交酵母的方法，模擬了體內雌激素受體的作用機制，將雌激素受體基因片段和受體共激活因子基因片段同時導入酵母細胞，用以篩選配體化合物對下游基因轉錄的影響。該方法不僅可以克服了單雜交酵母菌種一旦發生回復突變，性狀很難回復的缺點，對測定環境化合物的雌激素干擾效應時也能夠更好的進行質量控制。且有證據表明核受體雙雜交酵母系統更加接近哺乳動物內分泌系統的真實作用情況(Nishihara,T.，Nishikawa,J.,2000,Journal?of?Health?Science.46(4):282-298)。與化學分析法相比，生物檢測方法具有操作簡單、快速、經濟、高效的優點，并且能直接測定環境樣品的內分泌干擾活性，表征可能的生態毒理效應。該類方法也存在不足之處，任何一種單一的生物檢測方法都只能提供有限的證據。

北美螢火蟲(Photinus?pyralis)的熒光素酶(Luciferase)是一個62kDa的單酶體，無需表達后修飾，直接具有完全酶活。熒光素酶在ATP、O₂以及Mg²⁺存在時，添加底物熒光素(D-luciferin)就會發出黃綠色的光。熒光素酶生物發光反應過程通常分為以下兩步：熒光素+三磷酸腺苷(ATP)→熒光素化腺苷酸(luciferyladenylate)+焦磷酸(PPi)；熒光素化腺苷酸+O₂→氧熒光素+磷酸腺苷(AMP)+光。因此，通過簡單測定熒光素酶生物發光的強度，就能夠表征暴露化合物對報告基因轉錄的影響。名稱為“重組熒光雙雜交酵母及其檢測方法與應用”、授權公告號為CN?102127561B的發明專利中公開了重組酵母，其基因型為MATα,ura?3-5,ade?2-101trp?1-901,leu?2-3,112,gal4△,met-,gal80△,URA::GAL1UAS-GAL1TATA-Luc。該重組酵母以酵母菌株Y187為骨架，Luc基因被整合到酵母染色體中GAL1UAS-GAL1TATA下游受其調控。與Y187相同的是，該重組酵母的GAL4基因和GAL80基因(Gal80是Gal4的負調控因子)被缺失,從而排除了細胞內源調控因子的影響。與Y187不同的是，該重組酵母具有HIS合成能力。該重組酵母基于GAL4系統，目前所有已知的該系統質粒均可根據需要在該宿主內復制或表達。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是檢測樣品中的天然雌激素和/或類雌激素化合物的濃度。