[發(fā)明專利]一種重組稀有鮈鯽雌激素受體雙雜交酵母gERβ1-GRIP1及其應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510098247.6
• 申請(qǐng)日: 2015-03-05
• 公開（公告）號(hào): CN104711204A
• 公開（公告）日: 2015-06-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王子健;楊明嘉;韋玉梅;馬梅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心
• 主分類號(hào): C12N1/19
• 分類號(hào): C12N1/19;C12N15/81;G01N33/68
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢;陳曉慶

1.一種雙雜交酵母，包括將含有稀有鮈鯽雌激素受體β1的配體結(jié)合域與DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的融合蛋白的編碼基因和含有雌激素受體共激活因子與轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的融合蛋白的編碼基因?qū)牖蛐蜑镸ATα,ura?3-5,ade?2-101trp?1-901,leu2-3,112,gal4△,met-,gal80△,URA::GAL1UAS-GAL1TATA-Luc的熒光酵母中得到雙雜交酵母。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙雜交酵母，其特征在于：所述含有稀有鮈鯽雌激素受體β1的配體結(jié)合域與DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的融合蛋白的編碼基因是通過pGBKT7-gERβ1酵母表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入的；

所述pGBKT7-gERβ1的構(gòu)建方法如下：用SEQ?ID?No.1替換pGBKT7的EcoR?I和BamH?I識(shí)別位點(diǎn)間序列，pGBKT7的其余序列保持不變，得到的重組載體即為pGBKT7-gERβ1；

所述含有雌激素受體共激活因子與轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的融合蛋白的編碼基因是通過pGAD424-GRIP1酵母表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入的。

3.一種雙雜交酵母，包括將pGAD424-GRIP1酵母表達(dá)質(zhì)粒和pGBKT7-gER?β1酵母表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入基因型為MATα,ura?3-5,ade?2-101trp?1-901,leu?2-3,112,gal4△,met-,gal80△,URA::GAL1UAS-GAL1TATA-Luc的熒光酵母中得到雙雜交酵母；

所述pGBKT7-gERβ1的構(gòu)建方法如下：用SEQ?ID?No.1替換pGBKT7的EcoR?I和BamH?I識(shí)別位點(diǎn)間序列，pGBKT7的其余序列保持不變，即得。

4.一種定性或定量檢測(cè)樣品中具有雌激素受體結(jié)合效應(yīng)的化合物的方法，包括如下步驟：

(1)培養(yǎng)權(quán)利要求1-3中任一所述的雙雜交酵母，制備所述雙雜交酵母處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雙雜交酵母菌液；

(2)將雌激素化合物溶液與步驟(1)的雙雜交酵母菌液混勻，制備成各暴露液，使得各暴露液中的所述雙雜交酵母含量均相同，雌激素化合物含量均不同；

(3)將所述各暴露液暴露培養(yǎng)，得到各暴露后溶液；

(4)在所述各暴露后溶液中加入發(fā)光底物，得到各酶反應(yīng)液；

(5)測(cè)定所述各酶反應(yīng)液的酶反應(yīng)發(fā)光值，即為各暴露后溶液的酶反應(yīng)發(fā)光值；

(6)以所述各暴露液的雌激素化合物含量為橫坐標(biāo)，所述各暴露后溶液的酶反應(yīng)發(fā)光值為縱坐標(biāo)，得到酶反應(yīng)發(fā)光值的劑量-效應(yīng)關(guān)系曲線1，所述酶反應(yīng)發(fā)光值的劑量-效應(yīng)關(guān)系曲線1為S型，具有第一個(gè)平臺(tái)期、線性上升期和第二個(gè)平臺(tái)期；

(7)根據(jù)公式1得到各暴露后溶液的發(fā)光效應(yīng)比值：

y＝f_n/f₀????(公式1)

公式1中：y—發(fā)光效應(yīng)比值；

f_n—所述各暴露后溶液的酶反應(yīng)發(fā)光值；

f₀—所述各暴露后溶液的酶反應(yīng)發(fā)光值的最大值；

(8)以所述各暴露液的雌激素化合物含量為橫坐標(biāo)，所述各暴露后溶液的發(fā)光效應(yīng)比值為縱坐標(biāo)，得到雌激素化合物的劑量-效應(yīng)關(guān)系曲線2及對(duì)應(yīng)的公式2：

y=A-D1+(x/C)B+D]]>????(公式2)

公式2中：y—發(fā)光效應(yīng)比值；

x—各暴露液的雌激素化合物含量；

A—最大發(fā)光效應(yīng)比值；

B—曲線2線性段的斜率；

C—半數(shù)效應(yīng)濃度；

D—各暴露液的雌激素化合物含量的檢測(cè)下限；

(9)按照公式1得到待測(cè)樣品暴露后溶液的發(fā)光效應(yīng)比值y，將y帶入步驟(8)得到的公式2中得到x，根據(jù)x得到待測(cè)樣品中的具有雌激素受體結(jié)合效應(yīng)的化合物的濃度；

所述發(fā)光底物為熒光素酶的底物。