[發明專利]一種皮質抑素生長抑素雙表達DNA疫苗及制備方法和應用

有效

• 申請號: 201510097328.4
• 申請日: 2015-03-05
• 公開（公告）號: CN104673735B
• 公開（公告）日: 2018-04-27
• 發明（設計）人: 楊利國;羅璇;梁愛心;韓麗;董方曉;淡新鋼
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N15/66;A61K48/00;A61K39/108;A61P3/00;C12R1/19
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所42001
• 代理人: 王敏鋒

技術領域

本發明屬于動物基因免疫技術領域，具體地說涉及一種皮質抑素生長抑素雙表達DNA疫苗及制備方法和應用，包括將生長抑素融合乙肝表面抗原表達基因S/2SS和皮質抑素融合乙肝表面抗原表達基因克隆到具有雙表達質粒載體pIRES中，之后轉化大腸桿菌DH5a；還涉及該疫苗在促進小鼠生長中的應用。

技術背景

生長抑素(SS)是下丘腦釋放的14肽激素，在動物體內具有廣泛的抑制作用，特別對生長及泌乳具有明顯的影響。許多研究證實，應用SS主動或被動免疫動物可以提高GH水平，促進動物生長和泌乳。由于生長抑素分子量小(1658kD)，免疫原性弱，生長抑素常規免疫時都要與蛋白載體偶聯或與蛋白基因等重組以增強生長抑素的免疫原性。國外已報道的有應用SS抗血清被動免疫或化學合成SS制成免疫原主動免疫羊、牛等家畜，可以顯著提高增重效果，但免疫維持時間短，且化學合成多肽疫苗成本高，基因工程表達產物純化繁雜，不利于生產推廣。國內已開發出激生I號、激生II號等促生長產品，即利用基因工程原理將SS與HbsAg融合基因插入到痘苗病毒的TK基因，構建重組痘苗病毒，接種到雞胚或細胞上培養產生表達SS-HbsAg融合蛋白的痘苗病毒活載體苗。但此重組活載體疫苗常因誘發機體對載體自身的免疫反應而不能重復使用，此外還存在毒力回升等安全性問題。生長抑素基因免疫可望克服這一缺點，成為促進動物生長的新途徑。

生長抑素DNA疫苗免疫原理是通過機體免疫體系激活識別反應原從而產生SS抗體，中和內源性SS，達到促使體內GH的增加，從而促進動物機體生長。本實驗室在研究生長抑素DNA疫苗優化構建上梁愛心等構建了真核pGM-CSF/SS生長抑素基因疫苗(專利號：ZL 200610125580.2)并在小鼠生長上進行口服免疫觀察對其生長的影響，結果顯示SS基因免疫可以有效提高小鼠的體增重，且增重與產生的抗生抑素抗體呈顯著相關關系。同時利用佐劑來提高生長抑素免疫原性，薛春林等利用CpGDNA序列的核酸佐劑可以提高GH及IGF-1的分泌水平，促進生長抑素DNA疫苗的免疫效果。嚴婷等(2006)構建含HbsAgPS S的減毒沙門氏菌口服SS基因疫苗，結果表明該疫苗進入體內不僅表達HBsPSS融合蛋白，刺激機體產生SS抗體促進動物生長，還一定程度上產生增強免疫作用。Han等(2008)以VP22作為佐劑構建生長抑素pEGS2SS-V疫苗，證實小鼠試驗實驗組體增重方面提高14.1％(P＜0.05)。由于DNA載體疫苗的抗性基因引起的生產成本高、導致臨床抗藥菌株的播散及被免疫動物的過敏不良反應的問題，本實驗梁愛心等成功構建非抗性篩選菌生長抑素真核表達質粒pGS/2SS(專利號：ZL 200810197981.8)，采用肌肉注射和口服兩種方式免疫B alb/C鼠，且采用了不同劑量組、不同免疫次數來驗證生長抑素DNA疫苗效果。其結果發現，肌肉注射免疫效果要比口服注射的免疫效果IgA、IgG、IgG1、gG2a抗體水平反應強烈，且增重效果增加。

生長抑素DNA疫苗發展到現階段，選用了單表達SS真核質粒，無論是在質粒載體上的選擇，SS基因片段數目(單拷貝和雙拷貝)以及通過增加佐劑提高生長抑素DNA疫苗促生長效果都做了大量的研究工作，在這些基礎上，生長抑素DNA疫苗在免疫小型動物的免疫應答和增重效果方面取得了較好的效果，但在大動物中免疫裸質粒的效果卻不是很佳。