[發明專利]用于多靶點基因擴增的Arm-PCR引物設計方法

有效

• 申請號: 201510095338.4
• 申請日: 2015-03-04
• 公開（公告）號: CN104611457B
• 公開（公告）日: 2019-05-10
• 發明（設計）人: 方雪恩;王麗娟;陳旭;徐凌佳;孔繼烈
• 申請（專利權）人: 上海速芯生物科技有限公司;復旦大學
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12Q1/6806;C12N15/11;C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種用于多靶點基因擴增的Arm?PCR引物設計方法，其是通過以下步驟實現的：a、用LAMP軟件代替icubate2.0在線軟件設計小片段靶基因的引物；b、將LAMP軟件設計出的內引物前面的成環引物序列換成Arm?PCR引物的通用接頭序列；c、Arm?PCR反應體系的配制；d、Arm?PCR反應條件的設定與運行；e、Arm?PCR產物的毛細管電泳檢測。本發明采用LAMP軟件設計出的引物組較多，有利于多重引物組的篩選，本發明用于多靶點基因擴增的Arm?PCR引物設計方法，可以使小片段靶基因的Arm?PCR引物得以成功設計，進而使Arm?PCR多重反應變得簡單可行。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體的說是涉及一種用于多靶點基因擴增的Arm-PCR引物設計方法，該方法使小片段靶基因的Arm-PCR引物得以設計，進而使Arm-PCR多重反應變得簡單可行。

背景技術

擴增子拯救多重PCR(amplicon rescue multiplex PCR，以下簡稱Arm-PCR)技術，其原理是針對多重PCR體系中的每個靶序列，分別設計兩對套式引物，使其可以形成4種擴增引物組合；由于每個靶序列都有4種可能的擴增模式，從而使得尋找不同靶序列最佳通用的擴增條件變得簡單可行，最終實現對多種靶基因的高特異性、高靈敏度的同步擴增。

LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification)法是2000年由Notomi等發明的一種新穎的恒溫核酸擴增方法。該方法采用特異地識別靶序列上6個區域的4條引物(2條外引物，2條內引物)及具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶，在65℃左右進行核酸的指數級擴增，其擴增效率可達109～1010個拷貝數量級。

發明內容

本發明的目的在于提供一種用于多靶點基因擴增的Arm-PCR引物設計方法，可以使小片段靶基因的Arm-PCR引物得以成功設計，進而使Arm-PCR多重反應變得簡單可行。

本發明是通過以下技術方案實現的：一種用于多靶點基因擴增的Arm-PCR引物設計方法，其是通過以下步驟實現的：

a、用LAMP軟件代替icubate 2.0在線軟件設計小片段靶基因的引物：將靶基因片段的序列導入LAMP軟件中，按照Arm-PCR引物設計的參數對LAMP軟件中的參數進行調整；

b、將LAMP軟件設計出的內引物前面的成環引物序列換成Arm-PCR引物的通用接頭序列：icubate 2.0在線軟件設計出的第一輪引物分為外向引物與內向引物，這與LAMP軟件設計出的引物相似，所以將LAMP軟件設計出的內引物前面的成環引物序列換成Arm-PCR引物的通用接頭序列，從而轉換成Arm-PCR引物；

c、Arm-PCR反應體系的配制；

d、Arm-PCR反應條件的設定與運行；

e、Arm-PCR產物的毛細管電泳檢測：在Arm-PCR第二步擴增所需要的超級引物的5’端要加上熒光標記，才能進行后續的毛細管電泳檢測。

以轉基因大豆GTS 40-3-2 NOS終止子和轉基因大豆A5547-127為例，引物組是由LAMP軟件設計的，將其內向上下游引物的成環引物換成Arm-PCR引物的通用接頭序列，從而轉換成Arm-PCR引物，其引物組包括正向外引物Fo、反向外引物Ro、正向內引物Fi、反向內引物Ri，用于Arm-PCR的第一步擴增；5’端ROX標記的超級上游引物Fs和下游引物Rs用于Arm-PCR的第二步擴增，其接頭序列與超級引物的序列相同，核苷酸序列分別如下所示：

1.A5547-127正向外引物Fo：CACAAGAGTGGATTGATGATCTAG；

A5547-127反向外引物Ro：CTCATGCAACCTAACAGATGG；

A5547-127正向內引物