[發(fā)明專(zhuān)利]用于多靶點(diǎn)基因擴(kuò)增的Arm-PCR引物設(shè)計(jì)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510095338.4
• 申請(qǐng)日: 2015-03-04
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104611457B
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-05-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 方雪恩;王麗娟;陳旭;徐凌佳;孔繼烈
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 上海速芯生物科技有限公司;復(fù)旦大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/686
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/686;C12Q1/6806;C12N15/11;C12N15/10
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.一種用于多靶點(diǎn)基因擴(kuò)增的Arm-PCR引物設(shè)計(jì)方法，其特征在于：所述用于多靶點(diǎn)基因擴(kuò)增的Arm-PCR引物設(shè)計(jì)方法是通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)的：

a、用LAMP軟件代替icubate2.0在線軟件設(shè)計(jì)小片段靶基因的引物：將靶基因片段的序列導(dǎo)入LAMP軟件中，按照Arm-PCR引物設(shè)計(jì)的參數(shù)對(duì)LAMP軟件中的參數(shù)進(jìn)行調(diào)整；

b、將LAMP軟件設(shè)計(jì)出的內(nèi)引物前面的成環(huán)引物序列換成Arm-PCR引物的通用接頭序列，從而轉(zhuǎn)換成Arm-PCR引物；

c、Arm-PCR反應(yīng)體系的配制；

d、Arm-PCR反應(yīng)條件的設(shè)定與運(yùn)行；

e、Arm-PCR產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳檢測(cè)；

引物組包括正向外引物Fo、反向外引物Ro、正向內(nèi)引物Fi、反向內(nèi)引物Ri，用于Arm-PCR的第一步擴(kuò)增；5’端ROX標(biāo)記的超級(jí)上游引物Fs和下游引物Rs用于Arm-PCR的第二步擴(kuò)增；

利用Arm-PCR檢測(cè)引物組進(jìn)行Arm-PCR反應(yīng)，包括如下步驟：以轉(zhuǎn)基因大豆A5547-127和轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2NOS終止子的質(zhì)粒為模板；PCR擴(kuò)增反應(yīng)：在PCR管中配制第一步反應(yīng)體系：引物液2.5μl，反應(yīng)液Mix 12.5μl，轉(zhuǎn)基因大豆A5547-127和GTS 40-3-2NOS終止子質(zhì)粒各2～5μl，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25μl；設(shè)置空白對(duì)照反應(yīng)時(shí)，用雙蒸水代替模板；將配制好的PCR管混勻后離心，并于95℃15min，94℃30s，60℃90s，72℃60s，15個(gè)循環(huán)；94℃15s，70℃90s，6個(gè)循環(huán)；60℃延伸30min，最后4℃保存；第二步PCR反應(yīng)體系為：超級(jí)引物液1μl，反應(yīng)液Mix 12.5μl，第一步PCR反應(yīng)產(chǎn)物1～2μl，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25μl；將配制好的PCR管混勻后離心，并于95℃15min；94℃30s，60℃90s，72℃60s，30個(gè)循環(huán)；60℃延伸30min，最后4℃保存；結(jié)果判斷：通過(guò)毛細(xì)管電泳檢測(cè)Arm-PCR擴(kuò)增結(jié)果；

引物的核苷酸序列分別如下所示：

1)A5547-127正向外引物Fo：CACAAGAGTGGATTGATGATCTAG；

A5547-127反向外引物Ro：CTCATGCAACCTAACAGATGG；

A5547-127正向內(nèi)引物

Fi：GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTACGGTTGGTTGCTGAGGTTG；

A5547-127反向內(nèi)引物

Ri：CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGTGCCTATAACAGCAACCACAG；

2)GTS 40-3-2NOS終止子正向外引物Fo：CAAACATTTGGCAATAAAGTTT；

GTS 40-3-2NOS終止子反向外引物Ro：CTAGTAACATAGATGACACCG；

GTS 40-3-2NOS終止子正向內(nèi)引物

Fi：GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTACAGATTGAATCCTGTTGCC；

GTS 40-3-2NOS終止子反向內(nèi)引物

Ri：CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGTTATTTTGTTTTCTATCGCGTATT；

3)超級(jí)上游引物Fs：GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTAC；

超級(jí)下游引物Fs：CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGT。