[發明專利]一種重組水貂α-干擾素的制備方法和應用

在審

• 申請號: 201510095208.0
• 申請日: 2015-03-03
• 公開（公告）號: CN104894157A
• 公開（公告）日: 2015-09-09
• 發明（設計）人: 張海玲;閆喜軍;趙建軍;張蕾;白雪;胡博;劉昊
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院特產研究所
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N15/21;A61K38/21;A61P31/14;A61P31/20;C12R1/84
• 代理公司: 四川君士達律師事務所 51216
• 代理人: 芶忠義

1.一種重組水貂α-干擾素的制備方法，其特征在于：包括：將水貂α-干擾素基因克隆至載體pGAPZαA中，實現畢赤酵母重組表達載體的構建及篩選，并在畢赤酵母中進行誘導表達，獲得重組水貂α-干擾素。

2.根據權利要求1所述的重組水貂α-干擾素的制備方法，其特征在于：所述的水貂α-干擾素基因序列如Seq?ID?NO：1所示。

3.根據權利要求1所述的重組水貂α-干擾素的制備方法，其特征在于：所述的水貂α-干擾素基因進行克隆時所用的引物為：

擴增水貂α-干擾素基因特異性上游引物如Seq?ID?NO：3所示；

擴增水貂α-干擾素基因特異性下游引物如Seq?ID?NO：4所示。

4.根據權利要求1所述的重組水貂α-干擾素的制備方法，其特征在于：所述的誘導表達的具體方法為：用含Zeocin?100mg/L的YPD液體培養基進行菌體的擴增培養，30℃，300rpm搖床培養至OD₆₀₀＝1.5；按1:100比例轉接到含Zeocin100mg/L的YPD液體培養基中，30℃，300rpm搖床培養至OD₆₀₀＝6-8，7000rpm，4℃，離心15min，獲得含有重組水貂α-干擾素的上清液。

5.根據權利要求1所述的重組水貂α-干擾素的制備方法，其特征在于：所述的畢赤酵母重組表達載體的構建及篩選，包括以下步驟：

首先將載體pGAPZα用Xho?Ⅰ和Xba?Ⅰ雙酶切后檢測回收，設計擴增水貂α-干擾素基因特異性引物，回收PCR基因片段用In-Fusion?HD?Cloning?Kit將處理后的片段和載體連接，經驗證得到插入正確的重組畢赤酵母載體，即將基因插入pGAP啟動子和α-alpha信號肽下游的Xho?Ⅰ/Xba?Ⅰ位點，構建成分泌型酵母表達重組質粒，以Bln?Ⅰ酶切載體呈線性化轉化酵母X-33，經含Zeocin?100mg/L的YPD培養基平板篩選和PCR鑒定分析，確定陽性菌株后作進一步的搖瓶發酵。

6.權利要求1～5任一項所述的方法制備獲得的重組水貂α-干擾素在制備治療犬瘟熱疾病的藥物中應用。

7.權利要求1～5任一項所述的方法制備獲得的重組水貂α-干擾素在制備治療水貂細小病毒感染疾病的藥物中應用。

8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于：所述應用的一種配方為50～100萬IU重組水貂α-干擾素：1ml止血敏：0.8ml安乃近注射液。