[發(fā)明專(zhuān)利]一種重組水貂α-干擾素的制備方法和應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510095208.0
• 申請(qǐng)日: 2015-03-03
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104894157A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-09-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張海玲;閆喜軍;趙建軍;張蕾;白雪;胡博;劉昊
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/81
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/81;C12N15/21;A61K38/21;A61P31/14;A61P31/20;C12R1/84
• 代理公司: 四川君士達(dá)律師事務(wù)所 51216
• 代理人: 芶忠義

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，特別涉及一種重組水貂α-干擾素的制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

干擾素是動(dòng)物中目前所知出現(xiàn)最早、作用最快的第一抵御病毒體系。已對(duì)人和鼠的干擾素進(jìn)行了深入研究，但對(duì)于水貂的干擾素研究相對(duì)較少。

水貂α-干擾素是由13個(gè)相關(guān)功能基因編碼的蛋白質(zhì)家族，亞型基因間編碼框大小一致，氨基酸同源性88.8-98.4％。成熟的水貂α-干擾素由167個(gè)氨基酸組成，誘導(dǎo)其分泌表達(dá)的信號(hào)肽由23個(gè)氨基酸組成。由于水貂的病毒性疾病種類(lèi)多、危害大，因此發(fā)展具廣譜抗病毒效應(yīng)的水貂干擾素具有重要意義。但干擾素的傳統(tǒng)提取方法產(chǎn)量低、操作繁瑣，很難推廣應(yīng)用，因而尋找一種高效生產(chǎn)干擾素的方法成為亟待解決的問(wèn)題。

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是應(yīng)用廣泛的一種真核表達(dá)系統(tǒng)，可胞外表達(dá)外源蛋白。相比于大腸桿菌等原核表達(dá)系統(tǒng)，它具有完整的蛋白表達(dá)、加工和修飾功能，而與桿狀病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞相比，它又具有培養(yǎng)成本低、產(chǎn)量高、便于產(chǎn)物的分離純化等優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái)，酵母表達(dá)系統(tǒng)的研究得到迅速發(fā)展，此系統(tǒng)具有高表達(dá)、高穩(wěn)定、高分泌的特點(diǎn)，其宿主菌畢赤酵母自身蛋白分泌量少，高活性外源蛋白的分泌量大，利于下游分離純化操作，能大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，是一種適宜表達(dá)外源基因的真核表達(dá)系統(tǒng)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在克服傳統(tǒng)獲得干擾素方法的不足，提供一種重組水貂α-干擾素的制備方法和應(yīng)用，所述的制備方法通過(guò)高效外源表達(dá)重組水貂α-干擾素的真核表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)。

本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種重組水貂α-干擾素的制備方法，包括：將水貂α2-干擾素基因克隆至載體pGAPZαA中，實(shí)現(xiàn)畢赤酵母重組表達(dá)載體的構(gòu)建及篩選，并在畢赤酵母中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲得重組水貂α-干擾素。

所述的水貂α-干擾素基因序列如Seq?ID?NO：1所示。

所述的水貂α-干擾素基因進(jìn)行克隆時(shí)所用的引物為：

擴(kuò)增水貂α-干擾素基因特異性上游引物：

5’-GAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGATGTGACCTGCCTCAGA-3’；

擴(kuò)增水貂α-干擾素基因特異性下游引物：

5’-GAGTTTTTGTTCTAGATTACTTCCTGCTCCGCA-3’。

所述的誘導(dǎo)表達(dá)的具體方法為：用含Zeocin?100mg/L的YPD液體培養(yǎng)基進(jìn)行菌體的擴(kuò)增培養(yǎng)，30℃，300rpm搖床培養(yǎng)至OD₆₀₀＝1.5；按1:100比例轉(zhuǎn)接到含Zeocin?100mg/L的YPD液體培養(yǎng)基中，30℃，300rpm搖床培養(yǎng)至OD₆₀₀＝6-8，7000rpm，4℃，離心15min，獲得含有重組水貂α-干擾素的上清液。

本發(fā)明的目的還可以采用以下的技術(shù)措施來(lái)進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)。

所述的畢赤酵母重組表達(dá)載體的構(gòu)建及篩選，包括以下步驟：

首先將載體pGAPZα用Xho?Ⅰ和Xba?Ⅰ雙酶切后檢測(cè)回收，設(shè)計(jì)擴(kuò)增水貂α-干擾素基因特異性引物，引物上下游分別有15個(gè)堿基與上述酶切后線(xiàn)性載體的兩端互補(bǔ)，回收PCR基因片段，直接用In-Fusion?HD?Cloning?Kit將片段和載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)質(zhì)粒PCR和雙酶切鑒定陽(yáng)性克隆，經(jīng)驗(yàn)證得到插入正確的重組畢赤酵母載體，即將基因插入pGAP啟動(dòng)子和α-alpha信號(hào)肽下游的Xho?Ⅰ/Xba?Ⅰ位點(diǎn)，構(gòu)建成分泌型酵母表達(dá)重組質(zhì)粒，以BlnⅠ酶切載體呈線(xiàn)性化后電擊轉(zhuǎn)化酵母X-33，轉(zhuǎn)化子經(jīng)Zeocin?100mg/L抗性篩選，菌落PCR鑒定分析，確定陽(yáng)性菌株后作進(jìn)一步的搖瓶發(fā)酵。

上述方法制備獲得的重組水貂α-干擾素在制備治療犬瘟熱疾病的藥物中應(yīng)用。

上述方法制備獲得的重組水貂α-干擾素在制備治療水貂細(xì)小病毒感染疾病的藥物中應(yīng)用。

上述應(yīng)用的一種優(yōu)選配方為50～100萬(wàn)IU重組水貂α-干擾素：1ml止血敏：0.8ml安乃近注射液。

本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：

本發(fā)明采用常規(guī)的PCR方法獲得水貂α-干擾素基因編碼區(qū)，克隆入畢赤酵母分泌型表達(dá)載體中，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌，篩選高抗性轉(zhuǎn)化子，實(shí)現(xiàn)重組蛋白在畢赤酵母中的分泌表達(dá)，并得到具有抗病毒活性的重組蛋白，蛋白濃度最高可達(dá)3.593mg/mL。另外，本發(fā)明通過(guò)優(yōu)化畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，提高了重組重組蛋白的抗病毒活性。

附圖說(shuō)明