[發明專利]一種水稻S5基因的功能性標記S5-n-j-i及基因分型方法

在審

• 申請號: 201510095163.7
• 申請日: 2015-03-04
• 公開（公告）號: CN104694645A
• 公開（公告）日: 2015-06-10
• 發明（設計）人: 郭濤;陳立凱;黃翠紅;周丹華;羅文龍;陳志強;王慧
• 申請（專利權）人: 郭濤
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

技術領域

本發明屬于植物生物技術領域，具體涉及一種水稻S5基因的功能性標記，本發明還涉及一種水稻S5基因的功能性標記基因分型的方法。

背景技術

研究表明，位于水稻6號染色體的雜種不育基因座S5是調控秈粳亞種間雜種的育性的關鍵基因，該基因編碼產物為天冬氨酰蛋白酶。S5基因具有三等位基因系統，分別是秈型S5ⁱ、粳型S5^j和廣親和型S5ⁿ三種等位基因型。秈稻和粳稻所編碼的天冬酰胺蛋白酶由于一個SNP的差異導致編碼的氨基酸的差異(273位的苯丙氨酸/亮氨酸)而引起雜交F1代胚囊敗育。廣親和水稻品種的S5蛋白由于缺失了N端信號肽，造成功能喪失，無論與秈稻還是粳稻雜交都不影響雜種育性。

在秈粳亞種水稻雜交親本中引入S5ⁿ的等位基因，能夠打破生殖隔離，有效克服秈粳亞種雜種不育，具有相當大的應用價值。然而，研究也表明，總體上S5ⁿ/S5ⁱ或者S5ⁿ/S5^j這兩種雜合基因型育性相對要比S5ⁱS5ⁱ或S5^jS5^j純合的兩種基因型要低，因此通過鑒定、設計使雜交親本含有相同S5ⁱ或者S5^j等位基因在育種上是較好的選擇。

目前，根據秈粳亞種間廣親和基因S5ⁿ在第6染色體存在136bp片段缺失的特征，已報道了InDel標記S5136和標記S5-t1，此類標記的局限性在于僅能對S5ⁿ單等位基因進行分型，而無法對秈粳等位基因S5ⁱ或S5^j進行分型。也有報道通過擴增秈、粳序列間存在差異的區段并結合芹菜核酸內切酶CELI對其進行酶切鑒定，但由于該標記使用了特殊的核酸內切酶CEL?I，難以廣泛應用，同時該標記也僅能夠區分S5ⁱ或S5^j這兩種等位基因。因此，開發新的功能性標記實現S5等位基因型的有效、可靠、快速鑒定，在秈粳雜種優勢、種質資源鑒定、育種群體篩選中具有重要價值。

發明內容

本發明的目的是提供一種水稻S5基因的功能性標記S5-n-j-i，利用該標記，在一個PCR體系中同時擴增2個變異位點，區分判別3種基因型，提高了檢測效率。

本發明還提供一種水稻S5基因的功能性標記S5-n-j-i的基因分型方法。

本發明所采用的第一技術方案是，一種水稻S5基因的功能性標記S5-n-j-i，所述標記S5-n-j-i由6條引物S5-n-F、S5-n-R、S5-i-F、S5-j-R、S5-O-F和S5-O-R構成，其中，S5-n-F的核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示，具體為：5，-TATGACCAGCACCATCTTCG-3’；S5-n-R的核苷酸序列如SEQ?ID?N?o.2所示，具體為：5’-GAGGGACACTCCAACTCGTC-3’；S5-i-F的核苷酸序列如SEQ?ID?No.3所示，具體為：5’-CCCTGATATTCTGAGTTACAAGGCACTC-3’；S5-j-R的核苷酸序列如SEQ?ID?No.4所示，具體為：5’-GGTCTCGTCAGTGGGCAAGCAGTAGTTT-3’；S5-O-F的核苷酸序列如SEQ?ID?No.5所示，具體為：5’-GCAAGATGGTGACAGACACGCT-3’；S5-O-R的核苷酸序列如SEQ?ID?No.6所示，具體為：5’-CAGTGAGTAGGTTGGCCTGTTGATT-3’；上述引物序列中帶下劃線的堿基為引入的錯配堿基。

本發明所采用的第二技術方案是，一種水稻S5基因的功能性標記S5-n-j-i的基因分型方法，利用上述的功能性標記S5-n-j-i，具體按照以下步驟實施：

步驟1、水稻基因組DNA的提取；

步驟2、利用步驟1中提取的基因組DNA為模板，構建PCR反應體系，加入上述的引物進行PCR擴增；

步驟3、將PCR擴增進行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測并進行基因型判定。

本發明的特點還在于，

步驟1中水稻基因組DNA的提取具體按照以下步驟實施：