[發明專利]一種水稻S5基因的功能性標記S5-n-j-i及基因分型方法

在審

• 申請號: 201510095163.7
• 申請日: 2015-03-04
• 公開（公告）號: CN104694645A
• 公開（公告）日: 2015-06-10
• 發明（設計）人: 郭濤;陳立凱;黃翠紅;周丹華;羅文龍;陳志強;王慧
• 申請（專利權）人: 郭濤
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

1.一種水稻S5基因的功能性標記S5-n-j-i，其特征在于，所述標記S5-n-j-i由6條引物S5-n-F、S5-n-R、S5-i-F、S5-j-R、S5-O-F和S5-O-R構成，其中，S5-n-F的核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示，具體為：5’-TATGACCAGCACCATCTTCG-3S5-n-R的核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所示，具體為：5’-GAGGGACACTCCAACTCGTC-3S5-i-F的核苷酸序列如SEQ?ID?No.3所示，具體為：5’-CCCTGATATTCTGAGTTACAAGGCACTC-3S5-j-R的核苷酸序列如SEQ?ID?No.4所示，具體為：5’-GGTCTCGTCAGTGGGCAAGCAGTAGTTT-3S5-O-F的核苷酸序列如SEQ?ID?No.5所示，具體為：5’-GCAAGATGGTGACAGACACGCT-3S5-O-R的核苷酸序列如SEQ?ID?No.6所示，具體為：5’-CAGTGAGTAGGTTGGCCTGTTGATT-3上述引物序列中帶下劃線的堿基為引入的錯配堿基。

2.一種水稻S5基因的功能性標記S5-n-j-i的基因分型方法，其特征在于，利用權利要求1所述的功能性標記S5-n-j-i，具體按照以下步驟實施：

步驟1、水稻基因組DNA的提取；

步驟2、利用步驟1中提取的基因組DNA為模板，構建PCR反應體系，加入權利要求1中所述的引物進行PCR擴增；

步驟3、將PCR擴增進行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測并進行基因型判定。

3.根據權利要求2所述的水稻S5基因的功能性標記S5-n-j-i的基因分型方法，其特征在于，所述步驟1中水稻基因組DNA的提取具體按照以下步驟實施：

(1)取適量新鮮葉片放在2mL離心管中加液氮搗碎，向離心管中加入1mL?CTAB抽提液，搖勻；

(2)置于65℃的水浴鍋或恒溫箱，每隔10min輕輕搖動一次，30-45min后取出；

(3)冷卻2min后，加入氯仿-異戊醇(24∶1)至滿管，上下劇烈搖動，使兩者混合均勻；

(4)離心管放入離心機中15,000r/min離心10min后取出；

(5)小心吸取上清液至新的滅菌離心管中，然后加入600μL預冷的異丙醇，上下輕輕搖動，使異丙醇與水層充分混合；

(6)-20℃放置20min，使DNA充分沉淀；

(7)10,000r/min瞬間離心，立即倒掉液體，再將離心管倒立于鋪開的紙巾上；

(8)1min后直立離心管，加入720μL?70％的乙醇及80μL?3M?NaAc溶液，輕輕搖動，用手指輕彈管尖，使DNA沉淀浮游于液體中；

(9)至少放置30min，使雜質充分溶解；

(10)10,000r/min瞬間離心，立即倒掉液體，加入800μL?70％的乙醇將DNA再次漂洗20-30min；

(11)15,000r/min離心3-5min，立即倒掉液體，將離心管倒立于鋪開的紙巾上；

(12)數分鐘后直立離心管，通風廚內干燥DNA；

(13)加入100μL?1×TE?Buffer，使DNA充分溶解；

(14)置于-20℃保存、備用。

4.根據權利要求2所述的水稻S5基因的功能性標記S5-n-j-i的基因分型方法，其特征在于，所述步驟2中特異性PCR反應體系如下：1μL的模板DNA，10μm/L的4個引物各0.3μL，7.5μL?2×Power?Taq?PCR?Master?Mix，其余由雙蒸滅菌水ddH2O補足15μL。

5.根據權利要求4所述的水稻S5基因的功能性標記S5-n-j-i的基因分型方法，其特征在于，所述步驟2中的PCR反應程序為：94℃預變性5min；35個循環，每個循環為：94℃40sec，57℃40sec，72℃30sec；72℃再延伸10min。