[發(fā)明專利]加工食品中核桃植物源性成分鑒別用HDA引物及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510093621.3
• 申請日: 2015-03-03
• 公開（公告）號: CN104673920B
• 公開（公告）日: 2017-01-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 周巍;張巖;劉東;張翠俠;李永波;馬超峰;李月華;劉濤;楊嵐;劉紅冉;王贊;王爽;章晶晶;張薇
• 申請（專利權(quán)）人: 河北省食品檢驗研究院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京科億知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)11350
• 代理人: 湯東鳳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于加工食品中核桃植物源性成分鑒別的HDA引物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

當(dāng)前核桃加工食品及飲品增長迅速，受到廣大消費(fèi)者的歡迎。隨之而來的問題是，在核桃制產(chǎn)品的制備過程中存在大量的不規(guī)范操作，使得所得終產(chǎn)品中核桃源成分的有無及其含量無法確定，導(dǎo)致核桃食品/飲品的質(zhì)量無法保障。

與此同時，隨著核酸擴(kuò)增技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，以核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)為基礎(chǔ)的檢測技術(shù)近年來得到了迅猛的發(fā)展。多種機(jī)制的等溫技術(shù)不僅誕生，而且有些技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成熟，完成了從實驗室到實際應(yīng)用的過渡，正逐步在分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、法學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛的運(yùn)用。特別是在現(xiàn)場快速檢測技術(shù)方面，核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)顯示了其突出的優(yōu)越性。更為重要的是，核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)由于不需要溫度變化的時間過程且擺脫了對精良儀器設(shè)備的依賴，使病原體的檢測實現(xiàn)了快速、簡便和高通量。在實際操作和儀器要求方面，這些等溫技術(shù)都比PCR技術(shù)更為簡單和廉價，從而更容易被開發(fā)成現(xiàn)場檢測的應(yīng)用產(chǎn)品。因此，等溫擴(kuò)增技術(shù)是核酸擴(kuò)增技術(shù)的發(fā)展方向，具有廣闊的應(yīng)用前景。

依賴解旋酶DNA等溫擴(kuò)增技術(shù)(Helicase-Dependent?isothermal?DNA?Amplification，簡稱HDA)是由美國NEB公司研究人員Vincent等于2004年發(fā)明一種新型核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)模擬體內(nèi)DAN在恒溫下復(fù)制的自然過程，在恒溫條件下利用生物復(fù)制系統(tǒng)的關(guān)鍵組分實現(xiàn)DNA的體外擴(kuò)增。主要是利用解旋酶在恒溫下解開DNA雙鏈，同時DNA單鏈結(jié)合蛋白(SSB)穩(wěn)定解開的單鏈為引物提供結(jié)合模板，然后由DNA聚合酶催化合成互補(bǔ)鏈。新合成的雙鏈在解旋酶的作用下又形成單鏈，并作為下一輪合成的模板進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，最終實現(xiàn)靶序列的指數(shù)增長。

HDA技術(shù)的優(yōu)點在于：等溫擴(kuò)增，在一個恒定溫度就能完成擴(kuò)增反應(yīng)，不需要像PCR那樣循環(huán)的溫度變化；原理簡單，HDA技術(shù)模擬自然界DNA的合成方式，原理清晰易懂；操作簡便，HDA對引物的設(shè)計與PCR相似，不需要復(fù)雜的引物設(shè)計。對于其他組分也不需要做任何特殊處理，只需要一個恒溫裝置即可進(jìn)行反應(yīng)；設(shè)備簡單，HDA不需要復(fù)雜的設(shè)備，只需要一個簡單的恒溫器，如果選用室溫可以進(jìn)行反應(yīng)的酶，甚至不需要恒溫器就可進(jìn)行反應(yīng)。因此，HDA技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用前景。

目前尚未見利用HDA法檢測核桃植物源成分含量的報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種加工食品中核桃植物源性成分鑒別用HDA引物及其應(yīng)用，利用該引物進(jìn)行相關(guān)檢測，無論檢測準(zhǔn)度、精度或?qū)Ｒ欢榷际掷硐搿?/p>

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

加工食品中核桃植物源性成分鑒別用HDA引物，所述HDA引物為：上游引物：如SEQ?ID?NO：1所示；下游引物：如SEQ?ID?NO：2所示。

利用上述HDA引物鑒別加工食品中核桃植物源性成分的方法，該方法包括如下步驟：

A、食品中DNA的提取：取待測食品樣品，采用試劑盒提取其中的DNA，保存?zhèn)溆茫?/p>

B、引物設(shè)計：引物對于檢測結(jié)果的準(zhǔn)度、精度、專一度起決定作用，直接采用上述兩條引物；

C、HDA反應(yīng)體系的建立：HDA反應(yīng)體系包括：5μL?10×緩沖液，0.04μmol?dNTPs，0.16μmol?ATP，10U?Bst?ploymerase，0.10-0.30μg?UvrD?helicase，1.0-5.0μg?T4gp32或1.0-6.0μg?RecA蛋白，25μM海藻糖，2μL模板食品DNA，上游引物和下游引物各20pmol，用ddH₂O補(bǔ)至50μL；

D、恒溫擴(kuò)增：將反應(yīng)體系放入60-70℃恒溫金屬浴中恒溫擴(kuò)增1-3h；

E、結(jié)果檢測：瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，利用凝膠成像系統(tǒng)成像分析結(jié)果。