[發明專利]加工食品中核桃植物源性成分鑒別用HDA引物及其應用

有效

• 申請號: 201510093621.3
• 申請日: 2015-03-03
• 公開（公告）號: CN104673920B
• 公開（公告）日: 2017-01-11
• 發明（設計）人: 周巍;張巖;劉東;張翠俠;李永波;馬超峰;李月華;劉濤;楊嵐;劉紅冉;王贊;王爽;章晶晶;張薇
• 申請（專利權）人: 河北省食品檢驗研究院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙)11350
• 代理人: 湯東鳳

1.加工食品中核桃植物源性成分鑒別用HDA引物，其特征在于：所述HDA引物為：

上游引物：如SEQ?ID?NO：1所示；

下游引物：如SEQ?ID?NO：2所示。

2.利用權利要求1所述的HDA引物鑒別加工食品中核桃植物源性成分的方法，其特征在于：該方法包括如下步驟：

A、食品中DNA的提取：取待測食品樣品，采用試劑盒提取其中的DNA，保存備用；

B、引物設計：引物對于檢測結果的準度、精度、專一度起決定作用，直接采用權利要求1記載的引物；

C、HDA反應體系的建立：HDA反應體系包括：5μL?10×緩沖液，0.04μmol?dNTPs，0.16μmol?ATP，10U?Bst?ploymerase，0.10-0.30μg?UvrD?helicase，1.0-5.0μg?T4?gp32或1.0-6.0μg?RecA蛋白，25μM海藻糖，2μL模板食品DNA，上游引物和下游引物各20pmol，用ddH₂O補至50μL；

D、恒溫擴增：將反應體系放入60-70℃恒溫金屬浴中恒溫擴增1-3h；

E、結果檢測：瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，利用凝膠成像系統成像分析結果。

3.根據權利要求2所述的鑒別加工食品中核桃植物源性成分的方法，其特征在于：步驟A中，食品中DNA提取的具體操作方法為：如果操作對象為固體樣品，則經液氮研磨成粉末后取0.1g，如果操作對象是液體樣品，則經冷凍干燥后取粉末0.1g；所得樣品粉末加入1.5mL離心管中，加入600μl?65℃預熱的BufferPCB和12μlβ-巰基乙醇，震蕩混勻，置于65℃水浴25min，間或混勻，加入等體積的氯仿，充分混勻，12,000rpm離心5min，吸取上層水相至一個干凈的1.5ml的離心管中，加入等體積BufferBD，顛倒混勻3-5次，再加等體積的無水乙醇，充分混勻后用移液器將其全部加入到Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒的吸附柱中，室溫靜置2min，10,000rpm離心1min，倒掉收集管中廢液，將吸附柱放回收集管中，加入500μlPWSolution，10,000rpm離心1min，倒掉收集管中廢液，將吸附柱放回收集管中，加入500μl?WashSolution，10,000rpm，離心1min，倒掉收集管中廢液，將吸附柱放回收集管中，12,000rpm離心2min，取出吸附柱，放入一個新的1.5ml離心管中，在吸附膜中央加入50μlTEBuffer，靜置3min，12,000rpm離心2min，得到的DNA溶液置于-20℃保存或直接用于后續步驟。

4.根據權利要求2所述的鑒別加工食品中核桃植物源性成分的方法，其特征在于：步驟C中，所述10×緩沖液包括100mM二硫蘇糖醇、350mM?Tris-HAc、100mM?MgSO₄和1mg/mL?BSA。

5.根據權利要求2所述的鑒別加工食品中核桃植物源性成分的方法，其特征在于：步驟C中，所述反應體系中還包括10U的Phi29嗜溫聚合酶。

6.根據權利要求2所述的鑒別加工食品中核桃植物源性成分的方法，其特征在于：步驟C中，所述UvrD?helicase的含量為0.15μg。

7.根據權利要求2所述的鑒別加工食品中核桃植物源性成分的方法，其特征在于：步驟C中，所述T4gp32的含量為4.5μg，或者RecA蛋白的含量為3.0μg。

8.根據權利要求2所述的鑒別加工食品中核桃植物源性成分的方法，其特征在于：步驟D中，將反應體系放入65℃恒溫金屬浴中恒溫擴增2h。

9.根據權利要求2所述的鑒別加工食品中核桃植物源性成分的方法，其特征在于：步驟E中，吸取5μL擴增產物進行1-2％瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件為80-120V，80-100mA，電泳時間40-50min，置市售凝膠成像系統進行結果分析，檢測產物。