[發明專利]一種香榧芽體內源激素的檢測方法無效

申請號：	201510092900.8	申請日：	2015-03-02
公開（公告）號：	CN104749383A	公開（公告）日：	2015-07-01
發明（設計）人：	梅麗;吳家勝;黃堅欽;劉穎坤	申請（專利權）人：	浙江農林大學
主分類號：	G01N33/74	分類號：	G01N33/74
代理公司：	四川君士達律師事務所 51216	代理人：	芶忠義
地址：	311300 浙***	國省代碼：	浙江;33
權利要求書：	查看更多	說明書：	查看更多
摘要：
搜索關鍵詞：	一種香榧體內激素檢測方法
鉆瓜網技術展會專利詞庫專利權人專利榜在售專利公布日期熱門專利

【說明書】：

技術領域

本發明屬于植物激素提取技術領域，具體涉及一種香榧芽體內源激素的檢測方法。

背景技術

植物激素是植物體內普遍存在的一系列微量有機化合物，它的主要功能是調節植物生長發育，主要包括生長素(IAA)、赤霉素(GA3)、細胞分裂素(CTK)、脫落酸(ABA)和乙烯(Eth)五大類，目前又發現寡糖素和油菜固醇內酯等化合物。這些植物激素與植物生長發育和代謝過程的調節控制密切相關，對生命活動、遺傳育種、栽培及貯藏保鮮領域的研究具有重要的意義。要深入了解植物激素與植物生長發育的關系，必須檢測激素在植物體內的分布及含量的變化。但激素含量甚微，通常為納克級，研究人員對其分析測定經歷了生物測定法、免疫分析法、物理化學分析法等階段。早期的激素鑒定幾乎全靠生物測定，因其靈敏性及專一性均不夠高，已較少使用。

免疫分析技術和高效液相色譜(HPLC)自20世紀70年代以來廣泛應用在植物激素的檢測中，植物激素的提取、純化和分析方法。其中，高效液相色譜法(HPLC)一直以來受到國內外學者的推崇，是已廣泛應用于除乙烯外激素的測定。高效液相色譜法靈敏度高、專一性強和重復性好，是較理想的植物內源激素分析方法，目前已被廣泛應用于植物內源激素的測定。但是，HPLC法在實際運用中，受多種因素限制，而且，在對于微量的激素和某些物種，檢測起來仍然有難度。

香榧(Torreya?grandis?cv.Merrillii)是紅豆杉科(Taxaceae)榧樹屬(Torreya)榧樹種(Torreya?grandis.Fort.ex?Lindl)中的自然變異類型經人工培育發展而成的優良品種，是我國特有的集果用、材用、藥用、油用及生態觀賞于一體的珍貴經濟樹種。香榧是裸子植物，切片分析表明，其花芽分化的時間分別是頭年10月至次年4月。研究闡明香榧花芽分化的機理，并由此研究開發能促進香榧早成花的新技術將具有重要現實意義。香榧的花芽分化過程也受控于各類內源激素的相互作用，研究不同激素在花芽分化期的變化規律，探討有效激素的平衡關系將有助于闡明香榧的花芽分化調控機理及研發調控技術。

發明內容

本發明的目的在于提供一種準確可靠，可用于常規的香榧植物激素檢測的方法，該方法利用酶聯免疫吸附分析法，具有靈敏性、特異性高，且方便、快速、安全、成本低廉的特點。

本發明具體通過以下技術方案實現：

一種香榧芽體內源激素的檢測方法，具體包括以下步驟：

1)采集香榧花芽置于提取液中4℃過夜浸提，3500轉/min離心15min，取上清液；

2)上清液過C-18固相萃取柱，萃取液濃縮，除去甲醇用稀釋液定容；

3)在96孔酶標板中分別加入標準物、待測樣和加有抗體的稀釋液，每孔50μl；

4)洗版4次，將加入酶標二抗的稀釋液中加入酶標板，每孔加100μl，在濕盒內，37℃下，溫育0.5h，洗板；

5)稱取鄰苯二胺溶于底物緩沖液中溶解，并添加30％H₂0₂，在每孔中加100μl，放入濕盒內，顯色適當后每孔加入50μl?2mol/L硫酸終止反應；

6)在酶聯免疫分光光度計上依次測定標準物各濃度和各樣品490nm處的OD值。

所述的提取液為將二叔丁基對甲苯酚的甲醇溶液，其中甲醇的濃度為80％，二叔丁基對甲苯酚的濃度為1mmol/L。

所述的稀釋液通過在500ml?PBS中加0.5ml?Tween-20和0.5g明膠后加熱制得。