[發明專利]改進的同型半胱氨酸檢測試劑及方法

有效

• 申請號: 201510091414.4
• 申請日: 2015-02-28
• 公開（公告）號: CN104630324B
• 公開（公告）日: 2016-11-09
• 發明（設計）人: 不公告發明人
• 申請（專利權）人: 北京愛必信生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/48
• 分類號: C12Q1/48;C12Q1/34;C12Q1/32
• 代理公司: 北京律智知識產權代理有限公司 11438
• 代理人: 劉春生;于寶慶

技術領域

本發明涉及改進的同型半胱氨酸檢測試劑及方法，尤其涉及利用酶催化反應、酶循環擴增法、酶比色法測定同型半胱氨酸的方法及試劑。

背景技術

同型半胱氨酸(Hcy)為含巰基氨基酸，是體內甲硫氨酸循環過程中的一個代謝中間產物。血液中總Hcy濃度的病理性升高會導致高同型半胱氨酸血癥。而高同型半胱氨酸血癥與作為人類第一殺手的動脈粥樣硬化、高血壓、心肌梗死等多種心血管疾病的發生有密切關系，是心血管疾病的一個新的獨立和重要的危險因素。同型半胱氨酸的檢測已作為臨床冠心病的一個獨立風險因子，并且其病理性偏高是引起動脈硬化最終導致心臟病和中風的罪魁禍首。

目前國內外已經把同型半胱氨酸作為心血管疾病的一個檢測指標。如果能給予病人及時的診斷和預測，進而采取相應措施，僅此一項每年可使數千萬人幸免于心肌梗塞或腦血管病，因此對同型半胱氨酸的提前診斷和預測就具有極其重要的意義。

現在國內外有多種同型半胱氨酸(Hcy)檢測方法，包括HPLC(高效液相色譜)、熒光偏振法、酶聯免疫吸附分析(ELISA)、裂解酶法、循環酶法等。高效液相(HPLC)方法靈敏度高，但儀器昂貴、操作非常復雜，不易于自動化操作；熒光偏振免疫檢測(FPIA)方法靈敏度高，檢測速度快，但價格昂貴，故短時間內不易普及；酶免疫分析法涉及到人工操作等，容易產生誤差；裂解酶法具有穩定性差及使用前需要新鮮配制的缺點，在使用上具有很大不便。當前國內外流行的Hcy檢測方法是Hcy循環酶法檢測試劑盒。該類試劑盒因為具備高通量、自動化、快速、準確、靈敏、不涉及人為操作、能直接用于生化分析儀等優點，而受到廣泛歡迎。現有技術的Hcy循環酶法檢測試劑盒有兩種：一種為甲基轉移酶、水解酶的循環酶法；另一種為胱硫醚循環酶法。胱硫醚循環酶法易受人體內源胱硫醚干擾，而甲基轉移酶、水解酶循環酶法因為不受人體內源的胱硫醚干擾，測值準確，而具有最大的市場占有率，并最為流行。但現有的甲基轉移酶、水解酶循環酶法依然存在穩定性差的缺點，靈敏度也需要進一步提高。因此，本領域依然存在對穩定性強、靈敏度高的甲基轉移酶、水解酶循環酶法及試劑盒的需求。

發明內容

本發明的第一方面涉及一種檢測樣品中同型半胱氨酸含量的檢測試劑，其由試劑1和試劑2組成，其中試劑1包含下述成分：還原劑，S腺苷甲硫氨酸，pH?8.0～10.0的緩沖液1，EDTA二鈉鹽，檢測氨的試劑一部分，乳酸脫氫酶，試劑2包含下述成分：同型半胱氨酸甲基轉移酶，腺苷同型半胱氨酸酶，腺苷脫氨酶(ADA)，穩定劑，pH?7.5～8.5的緩沖液2，硫酸鎂，檢測氨的試劑的剩余部分。

在一些實施方案中，同型半胱氨酸甲基轉移酶的用量為0.5～80KU/L，優選地，1-60KU/L，更優選地，5-40KU/L，更優選地，10-30KU/L，最優選地，20KU/L，和/或腺苷同型半胱氨酸酶的用量為0.5～50KU/L，優選地，1-40KU/L，更優選地，10-30KU/L，最優選地，20KU/L，和/或ADA的用量為0.1～150KU/L，優選地，0.5～100KU/L，更優選地，1～50KU/L，更優選地，2～20KU/L，最優選地，5KU/L，和/或乳酸脫氫酶的用量為0.5～20KU/L，優選地，1～10KU/L，更優選地，1～5KU/L，最優選地，2KU/L，并且其中，腺苷同型半胱氨酸酶的用量大于同型半胱氨酸甲基轉移酶的用量，且ADA的用量相對于反應體系是過量的。

在一些實施方案中，S腺苷甲硫氨酸為商業可獲得的產品或利用ATP、蛋氨酸、蛋氨酸轉腺苷酶的循環酶反應生成，其中ATP和蛋氨酸位于試劑1，蛋氨酸轉腺苷酶位于試劑2；優選地，ATP的濃度為0.5mM～80mM，更優選地，1～60mM，更優選地，5-30mM，更優選地，8-15mM，最優選地，10mM；優選地，蛋氨酸的濃度為0.5～80mM，更優選地，1～40mM，更優選地，2-20mM，更優選地，3-10mM，最優選地，5mM；優選地，蛋氨酸轉腺苷酶的用量為0.1～100KU/L，更優選地，1～50KU/L，更優選地，2～30KU/L，更優選地，3～10KU/L，最優選地，5KU/L，并且其中，ATP大于蛋氨酸的量，優選地，蛋氨酸轉腺苷酶的用量大于同型半胱氨酸甲基轉移酶的用量。

在一些實施方案中，還原劑是含硫還原劑或三-(羧乙基)磷化氫鹽酸鹽(TCEP)，優選地，含硫還原劑為二硫蘇糖醇(DTT)或巰基乙醇，優選地，DTT的濃度為1.0～9mM，更優選地，1.2～7mM，更優選地，1.5～3mM，最優選地，1.5mM。