[發明專利]一種檢測腫瘤標志物DKK1 濃度的酶聯免疫試劑盒

在審

• 申請號: 201510090581.7
• 申請日: 2015-02-28
• 公開（公告）號: CN105588941A
• 公開（公告）日: 2016-05-18
• 發明（設計）人: 王鋒;高鵬;吳丹;沈秋瑾;覃文新
• 申請（專利權）人: 蘇州飛康生物醫藥有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及腫瘤診斷技術領域，特別涉及一種檢測腫瘤標志物DKK1濃 度的酶聯免疫試劑盒。

背景技術

在全世界范圍內，肝細胞癌(HCC)是第六種最常見的惡性疾病和第三 種與癌癥相關的死因。而我國的肝細胞癌高風險人群，包括各種肝炎病毒 長期攜帶者和肝硬化患者，高達1.5億。肝細胞癌的5年總生存率僅為 3-5％，這個極低的生存率的部分原因是因為缺乏一種及時和有效的診斷， 導致在確診肝細胞癌時已經有60-70％的患者錯過了最佳治療時機。

上海市腫瘤研究所發現的血清蛋白DKK1，是一個比現有肝細胞癌診斷 標志物甲胎蛋白AFP性能更優秀的標志物。該所的研究結果顯示，DKK1蛋 白對肝細胞癌總體診斷的靈敏度為69.1％，特異度為90.6％；特別是對早 期肝細胞癌和小肝癌的診斷靈敏度分別為70.9％和58.5％，特異性分別為 90.5％和84.7％。另外，DKK1蛋白能夠彌補AFP對肝細胞癌診斷能力的不 足，對甲胎蛋白陰性肝細胞癌的診斷靈敏度為70.4％、特異度為90％。同 時，DKK1蛋白與AFP聯合應用，可將肝細胞癌總體診斷率提高至88％。因 此迫切需要發展一種能夠快速、準確和相對廉價地檢測DKK1蛋白的方法和 產品，以便大規模地對肝細胞癌進行普查，盡早診斷，提高患者的生存率 和全民身體健康。

對血清中DKK1濃度的檢測主要采用針對DKK1的抗體，利用抗原-抗體 的特異性反應，再加上特定的顯色基團對反應量進行測量。而不同的顯色 基團和抗原-抗體反應的載體決定了每種檢測方法的優缺點。目前國內并沒 有一種能夠高靈敏、高特異和相對廉價地檢測血清DKK1蛋白的方法和試劑 盒。中國專利CN101398433公布了一種基于時間分辨熒光免疫分析方法的 試劑盒，該方法需要用到大多數醫院并不配備的時間分辨熒光免疫分析儀， 并且該方法還需要用到較為昂貴的熒光標記物，不利于對DKK1的大規模普 查。中國專利CN102507951公布了一種聯合檢測腫瘤標志物的酶聯免疫檢 測試劑盒，由包被有神經元特異性烯醇化物酶(NSE)、細胞角蛋白片段 21-1(CYFRA21-1)和Dkkopf1(DKK1)單克隆抗體的多孔板，辣根過氧 化物酶標的NSE、CYFRA21-1和DKK1，顯色底物TMB和底物終止液組成； 所述多孔板每孔包被NSE單克隆抗體1-4ug/ml；每孔包被CYFRA21-1單 克隆抗體1-2ug/ml；每孔包被DKK1單克隆抗體1-2ug/ml；NSE、 CYFRA21-1、DKK1三種檢測性抗體按4:4:2比例加入多孔板孔中，總體積 為100ul；該發明公布的試劑盒雖然可以同時檢測兩種或三種腫瘤相關抗 原，但由于分散了每種抗原的檢測精度及靈敏性，且針對DKK1抗原的檢測 僅采用了一種DKK1抗體，因而針對DKK1抗原的檢測精度難以滿足對腫瘤 的快速、準確的檢測。此外，國外雖然有檢測DKK1蛋白的酶聯免疫試劑盒 (貨號DKK100，R&DSystems公司，美國)，但是其價格昂貴(～￥6000/ 試劑盒)，不利于我國眾多肝細胞癌高風險人群對DKK1大規模普查的需求。

發明內容

為解決上述技術問題，本發明的目的在于提供一種檢測腫瘤標志物 DKK1濃度的酶聯免疫試劑盒，以匹配自動分析系統實現快速、準確和相對 廉價地用于大規模臨床檢驗腫瘤標志物DKK1。

本發明的另一目的在于提供一種檢測腫瘤標志物DKK1濃度的酶聯免 疫試劑盒的制備方法及應用。

為達到上述目的，本發明的技術方案如下：

一種檢測腫瘤標志物DKK1濃度的酶聯免疫試劑盒，由包被有DKK1單 克隆抗體1的多孔板、酶標記的DKK1單克隆抗體2、顯色底物和底物終止 液組成；其中，DKK1單克隆抗體1為10C3；DKK1單克隆抗體2為6E8；此 處基于雙抗體夾心法的原理，包被抗體和檢測抗體選用不同抗體。本發明 總共測試了8個不同的DKK1單克隆抗體，每兩兩配對為包被抗體和檢測抗 體，然后根據每組配對的靈敏性和特異性，選定我司與上海銳勁生物技術 有限公司合作生產的靈敏性和特異性均優的10C3和6E8分別為包被抗體和 檢測抗體。

其中，所述酶標記的DKK1單克隆抗體2的保護液由pH＝7.2的10mM磷 酸鹽緩沖液、0.5％的牛血清白蛋白、0.01％的硫柳汞和50％甘油組成。