[發明專利]一種體外誘導擴增NK細胞的方法

有效

• 申請號: 201510090232.5
• 申請日: 2015-02-28
• 公開（公告）號: CN104651310B
• 公開（公告）日: 2017-10-10
• 發明（設計）人: 劉軍權;陳錦陽;楊陽
• 申請（專利權）人: 浙江衛未生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 杭州華知專利事務所33235
• 代理人: 寧岡

技術領域

本發明屬于生物醫藥領域，具體涉及利用三葉青提取物的一種體外誘導擴增NK細胞的方法。

背景技術

近年來，腫瘤的生物治療已經成為腫瘤治療領域研究的熱點。NK細胞是一類獨立的淋巴細胞群，NK細胞主要通過細胞毒活性而顯示生物學效應，可直接殺傷腫瘤細胞、病毒感染的細胞，胞內寄生菌等。NK細胞可以識別自身正常細胞和異常組織細胞，其僅殺傷異常細胞而對宿主正常組織細胞沒有細胞毒作用。此外，NK細胞通過分泌多種細胞因子，在免疫調節和某些免疫細胞分化中發揮重要作用。NK細胞主要以組織相容性復合物(major histocompatibility complex，MHC)非限制性方式識別腫瘤，通過顆粒酶B(granzyme B)和穿孔素(perforin)等途徑殺傷腫瘤細胞，而T細胞表面的CD107aPb分子，與T細胞活化以后脫顆粒過程相關，其比值可以直接反應該效應細胞具有的特異性殺傷活性。

同時，NK細胞還能與其它固有免疫細胞和適應性免疫細胞相互作用，協同發揮抗腫瘤作用。目前NK細胞已經成為腫瘤患者過繼免疫治療的重要效應細胞。由此可見，為滿足生物學功能研究和臨床過繼細胞免疫治療需要，擴增出高效和較多數量的NK細胞是許多學者共同研究的課題。

現階段體外擴增NK細胞主要采取飼養層細胞共培養法和免疫磁珠分選法，但飼養層細胞共培養是將NK細胞添加到經改造后的腫瘤細胞株，這樣改造在臨床上應用的安全性沒有得到保障，而免疫磁珠分選法操作過程繁瑣，成本高，不適合臨床大規模應用。

發明內容：

為了解決現有技術中存在的問題，本發明提供一種體外誘導擴增NK細胞的方法，可在體外培養條件下獲得大量的、應用安全的、純度較高的以及殺傷活性強的NK細胞，從而使得該細胞達到能夠安全有效的應用于臨床的質量指標。

為實現該發明目的，本發明采用的技術方案為：一種體外誘導擴增NK細胞的方法，包括向NK細胞培養液中添加三葉青提取物，所述的三葉青提取物的濃度為0.00625μg/ml～9.76μgg/ml。

更具體的，本發明的體外誘導擴增NK細胞的方法，包括以下步驟：

(1)單個核細胞分離：靜脈穿刺采集患者外周血，轉移至含肝素鈉的抗凝瓶中，上下混勻，將外周血樣本移至離心管進行離心，棄上層血漿，生理鹽水稀釋血樣，淋巴分離液分離單個核細胞，生理鹽水重懸單個核細胞，離心收集單個核細胞；

(2)細胞種瓶：將上述單個核細胞用含rhIL-2的NK細胞培養液稀釋至NK細胞濃度為2×10⁵～1×10⁶/ml，接種于6孔細胞培養板中，毎孔5ml，于37℃、5％CO2培養箱培養；

(3)細胞擴增：每2天半量換液1次，并調整細胞密度為4×10⁴～6×10⁴/mL，NK細胞培養至第7天，向培養液中添加三葉青提取物，濃度為0.00625μg/ml～9.76μg/ml，此后繼續培養；

(4)細胞收集：培養3至21天，收集培養的NK細胞。

優選的，步驟(2)中的rhIL-2的濃度為500U/ml。

優選的，步驟(2)中NK細胞濃度為3.5×10⁵ml。

優選的，步驟(3)中調整細胞密度為5×10⁴/ml。

優選的，步驟(3)中三葉青提取物的濃度為0.01μg/ml～2.44μg/ml。

優選的，所述的三葉青提取物為三葉青總提取物，其制備方法為用乙醇溶液加熱回流三葉青而提取得到的。

優選的，所述的三葉青提取物為水煮脫糖部位Th-w3，其制備方法為經有機溶劑提取后的三葉青藥材用水煮后減壓回收蒸干。

優選的，所述的三葉青提取物為石油醚部位Th-p，取三葉青總提取物，用石油醚進行分步萃取得到。

優選的，所述的三葉青提取物為水部位脫糖部位Th-w2，其制備方法為三葉青總提取物的水部位除去糖分，用30％乙醇水洗脫溶液蒸干后得到。

本發明通過向NK細胞培養液中加入三葉青提取物擴增自然殺傷細胞的方法的在于：