[發明專利]一種體外誘導擴增NK細胞的方法

有效

• 申請號: 201510090232.5
• 申請日: 2015-02-28
• 公開（公告）號: CN104651310B
• 公開（公告）日: 2017-10-10
• 發明（設計）人: 劉軍權;陳錦陽;楊陽
• 申請（專利權）人: 浙江衛未生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 杭州華知專利事務所33235
• 代理人: 寧岡

1.一種體外誘導擴增NK細胞的方法，其特征在于包括向NK細胞培養液中添加三葉青提取物，所述的三葉青提取物的濃度為0.00625μg/ml～9.76μg/ml；所述三葉青提取物為三葉青總提取物，其制備方法為取三葉青干燥藥材，加5倍體積80％乙醇水溶液浸泡24h后，加熱回流提取，共3次，每次40min，合并提取液，過濾，減壓回收蒸干，得三葉青總提取物；

或者，

所述三葉青提取物為水煮脫糖部位Th-w3，其制備方法為：取三葉青干燥藥材200g，加5倍體積80％乙醇水溶液浸泡24h后，加熱回流提取，共3次，每次40min，合并提取液，除去提取液后的三葉青藥材用水煮后減壓回收蒸干，獲得脫水物2.1克；

或者，

所述三葉青提取物為石油醚部位Th-p，取三葉青總提取物，加水混懸，采用10倍體積的水飽和石油醚進行萃取，得到石油醚部位TH-p；

或者，

所述三葉青提取物為Th-w2，其制備方法為：取三葉青干燥藥材200g，加5倍體積80％乙醇水溶液浸泡24h后，加熱回流提取，共3次，每次40min，合并提取液，過濾，減壓回收蒸干，得總提取物TH-t 21.6g，取此總提取，加水混懸，采用10倍體積的水飽和石油醚，進行萃取，得到石油醚部位TH-p 0.15g，用乙酸乙酯萃取得到乙酸乙酯部位TH-a 0.58g，用正丁醇萃取得到正丁醇部位TH-b 2g，以及水部位TH-w，取水部位TH-w進行大孔吸附樹脂色譜，先使用純水進行洗脫，除去糖分，再使用10％、30％、60％、95％乙醇水溶液分別依次洗脫，其中，30％乙醇水洗脫溶液蒸干后得到水部位脫糖流分TH-w2。

2.根據權利要求1所述的體外誘導擴增NK細胞的方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)單個核細胞分離：靜脈穿刺采集患者外周血，轉移至含肝素鈉的抗凝瓶中，上下混勻，將外周血樣本移至離心管進行離心，棄上層血漿，生理鹽水稀釋血樣，淋巴分離液分離單個核細胞，生理鹽水重懸單個核細胞，離心收集單個核細胞；

(2)細胞種瓶：將上述單個核細胞用含rhIL-2的NK細胞培養液稀釋至細胞濃度為2×10⁵～1×10⁶/ml，接種于6孔細胞培養板中，毎孔5ml，于37℃、5％CO2培養箱培養；

(3)細胞擴增：每2天半量換液1次，并調整細胞密度為4×10⁴～6×10⁴/mL，NK細胞培養至第7天，向培養液中添加三葉青提取物，濃度為0.00625μg/ml～9.76μg/ml，此后繼續培養；

(4)細胞收集：培養3至21天，收集培養的NK細胞。

3.根據權利要求2所述的體外誘導擴增NK細胞的方法，其特征在于所述步驟(2)中的rhIL-2的濃度為500U/ml。

4.根據權利要求2所述的體外誘導擴增NK細胞的方法，其特征在于所述步驟(2)中NK細胞濃度為3.5×10⁵ml。

5.根據權利要求2所述的體外誘導擴增NK細胞的方法，其特征在于所述步驟(3)中調整細胞密度為5×10⁴/ml。

6.根據權利要求1或2所述的體外誘導擴增NK細胞的方法，其特征在于所述三葉青提取物的濃度為0.01μg/ml～2.44μg/ml。