[發明專利]一種嗜水氣單胞菌氟喹諾酮類藥物耐藥基因檢測方法

在審

• 申請號: 201510087986.5
• 申請日: 2015-02-26
• 公開（公告）號: CN104878082A
• 公開（公告）日: 2015-09-02
• 發明（設計）人: 張丹鳳;林淦;胡元慶;陳凡;陳國平;潘裕添
• 申請（專利權）人: 閩南師范大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12R1/01
• 代理公司: 廈門市首創君合專利事務所有限公司 35204
• 代理人: 李雁翔

技術領域

本發明屬于病原菌檢測技術領域，具體涉及一種嗜水氣單胞菌氟喹諾酮類藥物耐藥基因檢測方法。

背景技術

1979年合成第三代喹諾酮藥諾氟沙星。它是4-Quinolone結構改造衍生物，在6位上加上一個氟(F)后，增加了脂溶性，增強了對組織細胞的穿透力，因而吸收好，組織濃度高，半衰期長，更大大增加了抗菌譜和殺菌效果。氟喹諾酮類對G-桿菌，包括綠膿桿菌均有良好抗菌作用，對G+球菌也具一定抗菌活性，尤其對耐藥G-桿菌，仍可呈現敏感。在氟喹諾酮類較廣泛使用的品種中，對綠膿桿菌作用較強的為環丙氟哌酸，其次為氟嗪酸。氟嗪酸對一般陰性桿菌的作用與環丙氟哌酸相仿或稍弱，90年代后開發的新品種多氟哌酸類某些品種，不僅抗G-桿菌活性與環丙氟哌酸相似，而且抗G+球菌作用加強，對MRSA有效，對衣原體、支原體、厭氧菌亦有一定作用，明顯優于環丙沙星。

國內外的大量研究表明，由于氟喹諾酮藥物長期和大量使用，嗜水氣單胞菌對氟喹諾酮類藥物的耐藥性十分嚴重。常見的氟喹諾酮耐藥基因已經發現的有：GyrA,GyrB,ParC,ParE等。耐藥性產生的直接后果是嚴重影響了臨床療效，尤其在人畜同藥的情況下，耐藥性通過水產產品等途徑引起的交叉傳播，直接對人體健康構成威脅。

目前我國水產產品耐藥性檢測控制中，傳統方法是通過測定嗜水氣單胞菌的最低抑菌濃度或抑菌圈大小測定嗜水氣單胞菌的耐藥性。傳統的藥敏試驗必須經過繁瑣的嗜水氣單胞菌分離純化、繁殖擴增等步驟，檢測周期長，最快也要48h左右。不利于臨床上及時的選藥治療。同時，藥敏試驗是在體外用藥物試探性的檢驗嗜水氣單胞菌的表型耐藥特性，不能檢測嗜水氣單胞菌的隱型耐藥性。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術缺陷，提供一種嗜水氣單胞菌氟喹諾酮類藥物耐藥基因檢測方法。

本發明的具體技術方案如下：

一種嗜水氣單胞菌氟喹諾酮類藥物耐藥基因檢測方法，包括如下步驟：

(1)收集嗜水氣單胞菌活菌體0.5～0.7g，用5～7mL去離子水重懸，反復凍融破碎細胞，離心后收集上清液，得到模板；

(2)將該模板與氟喹諾酮類藥物耐藥基因檢測引物GyrA-F、GyrA-R、GyrB-F、GyrB-R、ParC-F和ParC-R共同混合后，進行PCR擴增，該PCR擴增的反應體系中包括超純水、PCR緩沖液、終濃度均為0.25～0.35mmol/L的dNTPs(dGTP、dCTP、dATP和dTTP)、終濃度為0.5～0.6mmol/L的GyrA-F、終濃度為0.5～0.6mmol/L的GyrA-R、終濃度為0.8～0.9mmol/L的GyrB-F、終濃度為0.8～0.9mmol/L的GyrB-R、終濃度為0.4～0.5mmol/L的ParC-F、終濃度為0.4～0.5mmol/L的ParC-R和終濃度為0.01～0.02U/uL的TaqDNA聚合酶，其中GyrA-F、GyrA-R、GyrB-F、GyrB-R、ParC-F和ParC-R分別如SEQ?ID?1、SEQ?ID?2、SEQ?ID?3、SEQ?ID?4、SEQ?ID?5和SEQ?ID?6，上述PCR緩沖液的10倍母液中包括30～35mM氯化鉀、pH8.3的10mMTris-HCl和0.01～0.02％硫酸鈉，25～30mM?MgCl₂；

(3)步驟(2)的PCR擴增結束后，進行瓊脂糖凝膠電泳并送交測序。

在本發明的一個優選實施方案中，所述步驟(1)為：收集嗜水氣單胞菌活菌體0.5～0.6g，用5～6mL去離子水重懸，反復凍融破碎細胞，10000～12000rpm離心10～15min后收集上清液，得到模板。

在本發明的一個優選實施方案中，所述PCR擴增的反應體系中包括超純水、PCR緩沖液、終濃度均為0.3mmol/L的dNTPs、終濃度為0.5mmol/L的GyrA-F、終濃度為0.5mmol/L的GyrA-R、終濃度為0.8mmol/L的GyrB-F、終濃度為0.8mmol/L的GyrB-R、終濃度為0.4mmol/L的ParC-F、終濃度為0.4mmol/L的ParC-R和終濃度為0.01U/uL的TaqDNA聚合酶。

在本發明的一個優選實施方案中，所述PCR緩沖液的10倍母液中包括30mM氯化鉀、pH8.3的10mMTris-HCl和0.01％硫酸鈉，25mM?MgCl₂。