[發明專利]一種嗜水氣單胞菌氟喹諾酮類藥物耐藥基因檢測方法

在審

• 申請號: 201510087986.5
• 申請日: 2015-02-26
• 公開（公告）號: CN104878082A
• 公開（公告）日: 2015-09-02
• 發明（設計）人: 張丹鳳;林淦;胡元慶;陳凡;陳國平;潘裕添
• 申請（專利權）人: 閩南師范大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12R1/01
• 代理公司: 廈門市首創君合專利事務所有限公司 35204
• 代理人: 李雁翔

1.一種嗜水氣單胞菌氟喹諾酮類藥物耐藥基因檢測方法，其特征在于：包括如下步驟：

(1)收集嗜水氣單胞菌活菌體0.5～0.7g，用5～7mL去離子水重懸，反復凍融破碎細胞，離心后收集上清液，得到模板；

(2)將該模板與氟喹諾酮類藥物耐藥基因檢測引物GyrA-F、GyrA-R、GyrB-F、GyrB-R、ParC-F和ParC-R共同混合后，進行PCR擴增，該PCR擴增的反應體系中包括超純水、PCR緩沖液、終濃度均為0.25～0.35mmol/L的dNTPs、終濃度為0.5～0.6mmol/L的GyrA-F、終濃度為0.5～0.6mmol/L的GyrA-R、終濃度為0.8～0.9mmol/L的GyrB-F、終濃度為0.8～0.9mmol/L的GyrB-R、終濃度為0.4～0.5mmol/L的ParC-F、終濃度為0.4～0.5mmol/L的ParC-R和終濃度為0.01～0.02U/uL的TaqDNA聚合酶，其中GyrA-F、GyrA-R、GyrB-F、GyrB-R、ParC-F和ParC-R分別如SEQ?ID?1、SEQ?ID?2、SEQ?ID?3、SEQ?ID?4、SEQ?ID?5和SEQ?ID?6，上述PCR緩沖液的10倍母液中包括30～35mM氯化鉀、pH8.3的10mMTris-HCl和0.01～0.02％硫酸鈉，25～30mM?MgCl₂；

(3)步驟(2)的PCR擴增結束后，進行瓊脂糖凝膠電泳并送交測序。

2.如權利要求1所述的一種嗜水氣單胞菌氟喹諾酮類藥物耐藥基因檢測方法，其特征在于：所述步驟(1)為：收集嗜水氣單胞菌活菌體0.5～0.6g，用5～6mL去離子水重懸，反復凍融破碎細胞，10000～12000rpm離心10～15min后收集上清液，得到模板。

3.如權利要求1所述的一種嗜水氣單胞菌氟喹諾酮類藥物耐藥基因檢測方法，其特征在于：所述PCR擴增的反應體系中包括超純水、PCR緩沖液、終濃度均為0.3mmol/L的dNTPs、終濃度為0.5mmol/L的GyrA-F、終濃度為0.5mmol/L的GyrA-R、終濃度為0.8mmol/L的GyrB-F、終濃度為0.8mmol/L的GyrB-R、終濃度為0.4mmol/L的ParC-F、終濃度為0.4mmol/L的ParC-R和終濃度為0.01U/uL的TaqDNA聚合酶。

4.如權利要求1所述的一種嗜水氣單胞菌氟喹諾酮類藥物耐藥基因檢測方法，其特征在于：所述PCR緩沖液的10倍母液中包括30mM氯化鉀、pH8.3的10mMTris-HCl和0.01％硫酸鈉，25mM?MgCl₂。

5.如權利要求1至4中任一權利要求所述的一種嗜水氣單胞菌氟喹諾酮類藥物耐藥基因檢測方法，其特征在于：所述PCR擴增的反應條件如下：94～95℃預變性10～12min，然后進入如下循環：94～95℃變性50s～1min、54～55℃退火45～50s、72～74℃延伸50s～1min，共30～35個循環，循環結束后于72℃延伸7～8min，2～4℃保存。

6.如權利要求5所述的一種嗜水氣單胞菌氟喹諾酮類藥物耐藥基因檢測方法，其特征在于：所述PCR擴增的反應條件如下：94℃預變性10min，然后進入如下循環：94℃變性1min、54℃退火50s、72℃延伸1min，共30個循環，循環結束后于72℃延伸8min，4℃保存。

7.如權利要求1所述的一種嗜水氣單胞菌氟喹諾酮類藥物耐藥基因檢測方法，其特征在于：所述步驟(3)的電泳條件為：2％瓊脂糖凝膠，80V電壓，時間40min。