[發明專利]利用靈芝蛋白制備的抗氧化多肽及其制備方法

有效

• 申請號: 201510087701.8
• 申請日: 2015-02-26
• 公開（公告）號: CN104610430B
• 公開（公告）日: 2018-02-27
• 發明（設計）人: 汪少蕓;鄭惠華;邵彪;陳惠;陳瑩瑩;吳偉杰;田貞樂;湯利兵
• 申請（專利權）人: 江蘇安惠生物科技有限公司
• 主分類號: C07K7/06
• 分類號: C07K7/06;C12P21/06;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/18;C07K1/20
• 代理公司: 南通市永通專利事務所(普通合伙)32100
• 代理人: 葛雷

技術領域

本發明提供了一種靈芝蛋白的抗氧化多肽及其制備方法，屬于生物技術領域。

背景技術

食品營養成分的氧化會產生過氧化物，其不僅會影響食品的營養價值，引起食品品質下降，嚴重的甚至還會導致攝入者的身體發生疾病。因此，尋找安全的抗氧化劑以抑制過氧化物產生一直是生化營養學的研究熱點。由于化學合成抗氧化劑比天然抗氧化劑具有更好的效果和更便宜的價格，因此其已經被廣泛應用于食品行業中。但是，目前有研究發現合成抗氧化劑對人體肝、脾、肺等器官具有蓄積性致癌作用，從而引起了人們對其安全性的擔憂，并且開始逐漸限制其在食品中的使用。于是人們把目光轉向天然抗氧化劑。α-生育酚是一種被最普遍使用的天然抗氧化劑，它能有效保持食品中油脂的穩定性，但是卻不利于食品保存。因此，我們有必要尋找一種其它來源的安全的天然抗氧化劑。

多肽是分子結構介于氨基酸和蛋白質之間的一類化合物，使蛋白質具有一定的生理功能。在人類的生命活動中，肽在體內的消化吸收優于游離的氨基酸，且有著區別于氨基酸的體內輸送體系。某些短肽在提供人體生長、發育所必需的營養物質的同時，還能夠防病治病，調節人體機能，這些具有生物活性的多肽被稱為生物活性肽。研究發現，很多不同來源的多肽都具有抗氧化能力，如水解酪蛋白、大豆蛋白、牛血清白蛋白、卵白蛋白、油料種子蛋白、小麥醇溶蛋白和玉米蛋白等得到的多肽都具有一定的抗氧化性。

靈芝(Ganoderma lucidum)屬于擔子菌綱多孔菌目靈芝科，是靈芝屬中分布最廣的物種，因其子實體中含有大量的藥理成分，而被視為極珍貴的藥用真菌。靈芝多肽是一類重要活性物質。 我國擁有豐富的靈芝資源， 靈芝中含有豐富蛋白質，利用現代生物技術對蛋白質資源進行深加工，合理的選用酶類等，通過工藝優化生物活性肽的產品得率將使得生物活性肽的研究具有更廣闊的前景。

發明內容

本發明提供了一種靈芝蛋白的抗氧化多肽及其制備方法，使抗氧化活性得以高效地實現。

本發明的一種抗氧化多肽，氨基酸序列為DVVKNAACG。

本發明還提供了一種抗氧化多肽的制備方法，以靈芝為原料提取蛋白，然后采用堿性蛋白酶對其進行酶解，分離純化、冷凍干燥得到抗氧化多肽；所述酶解條件為：pH為8.0、溫度45℃、酶解時間為9h、酶-底物配比為3000U/g；所述酶為堿性蛋白酶。所述分離純化的手段包括超濾、SP-Sephadex C-25離子交換色譜、Sephadex G-50分子篩和RP-HPLC反相高效液相色譜。

所述分離純化的具體步驟為：

（1）酶解產物首先利用分子量截留范圍為10000Da和5000Da的超濾膜對酶解產物進行超濾分離，將其分為3個分子量范圍不同的組分，分別為分子量大于10000Da的組分、分子量介于10000Da和5000Da的組分、分子量小于5000Da的組分；（2）收集具有最佳抗氧化活性的組分，再用SP-Sephadex C-25陽離子交換色譜進行分離，上樣后洗去未吸附組分，再以含0～0.35mol/L NaCl的0.02mol/L、pH8.0Tris－鹽酸緩沖液進行線性梯度洗脫，流速為0.5ml/min，在215nm下進行測量，測定各吸收峰對應的洗脫組分的抗氧化活性；（3）收集具有最佳抗氧化活性的峰，再用Sephadex G-50凝膠色譜進行分離，洗脫液為去離子水，流速為0.5ml/min，在215nm下進行測量，測定各吸收峰對應的洗脫組分的抗氧化活性；（4）收集具有最佳抗氧化活性的峰，再利RP-HPLC反相高效液相色譜進行進一步的分離，將分離出來的最好的抗氧化活性組分利用RP-HPLC反相高效液相色譜進行再進一步的分離，所用色譜柱為Gemini 5μ C18，上樣量為100μL，流速為1ml/min，檢測波長為215nm。洗脫液自含體積分數為10%乙腈和90%水（v/v）的混合液開始，至體積分數為90%乙腈和10%水（v/v）的混合液結束，進行梯度洗脫，收集體積分數為43%乙腈和57%水（v/v）處的洗脫峰,得到本發明的高純度的抗氧化多肽。利用蛋白質固相序列分析儀鑒定多肽的氨基酸序列，得到本發明的抗氧化多肽的氨基酸序列為：DVVKNAACG。

為了實現上述方案，本發明采取的具體步驟如下：

靈芝蛋白的提取

本發明所采用的靈芝蛋白為異樣發酵獲得。

靈芝蛋白質提取工藝條件為：將靈芝清洗3-5次， 超聲波破碎，浸提。浸提pH為 8.0，料液比為20:1（重量比）。浸提時間12h，離心10000g 20分鐘，收集上清液，經過濾、濃縮和冷凍干燥后得到靈芝蛋白。