[發(fā)明專利]一種荷葉鐵線蕨離體再生體系的建立方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510087219.4
• 申請(qǐng)日: 2015-02-25
• 公開（公告）號(hào): CN104663443B
• 公開（公告）日: 2017-01-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李軍;楊惠才
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 李軍
• 主分類號(hào): A01H4/00
• 分類號(hào): A01H4/00
• 代理公司: 玉林市振盛專利商標(biāo)代理事務(wù)所45109
• 代理人: 吳安儀

技術(shù)領(lǐng)域

????本發(fā)明涉及植物生物技術(shù)中植物組織培養(yǎng)的方法，具體地說(shuō)，涉及一種荷葉鐵線蕨離體再生體系的建立方法。

背景技術(shù)

蕨類植物也稱羊齒植物,起源于古生代志留紀(jì)和泥盆紀(jì)的裸蕨,分類地位介于苔蘚植物和種子植物之間。蕨類植物除少數(shù)具有假根外,均有根、莖、葉的分化,內(nèi)有維管組織,是維管植物中的一群,在現(xiàn)今的分類系統(tǒng)上被認(rèn)為是組成現(xiàn)代植物界的大門之一,是地球上古代和現(xiàn)代植物界中的一個(gè)重要組成部分。蕨類植物的生活史中有兩個(gè)能獨(dú)立生活的植物體,及孢子體和配子體,具有明顯的世代交替現(xiàn)象。蕨類植物以孢子傳播,因孢子很輕,可以傳播很遠(yuǎn)的距離,因而在地理分布上蕨類植物比種子植物更廣泛。在我國(guó)，蕨類植物擁有悠久的民間藥食兼用傳統(tǒng)，其不僅營(yíng)養(yǎng)成分齊全、含量豐富、鮮美可口,而且具有舒筋活血、除濕鎮(zhèn)痛、寧神安眠、清熱解毒、止咳化痰、止血驅(qū)蟲和止痢抑菌等功效。多數(shù)蕨類植物具有較高的觀賞價(jià)值,有“無(wú)花之美”之稱，日本、歐美等國(guó)更是把蕨類植物視為高貴素雅的象征。

荷葉鐵線蕨（Adiantum?reniforme?var.sinense）系鐵線蕨科鐵線蕨屬植物,為中國(guó)特有種,國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物。荷葉鐵線蕨為多年生同型孢子蕨,葉形似荷葉,具有較高的藥用價(jià)值而聞名。由于人為過(guò)度挖掘以及生境被破壞等原因，使得荷葉鐵線蕨瀕臨滅絕。近年來(lái)隨著人們對(duì)荷葉鐵線蕨的保護(hù)和研究,其株型小巧,別致優(yōu)美的觀賞特性也受到人們的關(guān)注而倍受青睞。目前在國(guó)內(nèi)關(guān)于蕨類植物再生體系的研究鮮有報(bào)道，因此，建立荷葉鐵線蕨的離體再生體系，對(duì)保護(hù)瀕危植物和進(jìn)行商品化生產(chǎn)具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

????本發(fā)明的目的在于提供出一種荷葉鐵線蕨離體再生體系的建立方法，本發(fā)明以荷葉鐵線蕨的成熟孢子為外植體，經(jīng)過(guò)外植體消毒、孢子萌發(fā)培養(yǎng)、增殖與分化等步驟建立了荷葉鐵線蕨離體再生體系，從而實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目的。

?本發(fā)明的一種荷葉鐵線蕨離體再生體系的建立方法，包括以下的步驟：

（1）外植體采取及處理：選擇孢子囊群蓋變?yōu)楹稚㈡咦幽胰簺]有開裂的孢子葉剪下,置于干燥紙袋中,自然晾干。5～7天后孢子囊自然開裂,孢子散落于紙袋中,清除袋內(nèi)雜質(zhì),收集干燥的孢子置于離心管中,并將裝有孢子的離心管置于冰箱2～4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）孢子的消毒：選取經(jīng)步驟（1）處理后的孢子置于1.5mL離心管中，在離心管中加入1～2滴吐溫和適量蒸溜水,蓋上離心管蓋,稍稍搖晃后平放靜置3～8min，然后將孢子在混合液中震蕩均勻后轉(zhuǎn)移到快速濾紙上,通過(guò)漏斗將過(guò)濾的廢水用錐形瓶接住并迅速將該過(guò)濾裝置置于超凈工作臺(tái)中，先用無(wú)菌水沖洗3～5次后用70%～80%乙醇浸泡10～40s，用無(wú)菌水清洗3～5次后用0.1%升汞溶液消毒1～10min，再用無(wú)菌水清洗3～5次后備用。

（3）孢子萌發(fā)培養(yǎng)：將經(jīng)步驟（2）處理后孢子配置成濃度為0.3～1.0mg/mL的孢子懸濁液接種于萌發(fā)培養(yǎng)基上進(jìn)行孢子萌發(fā)培養(yǎng)。接種后置于每天光照12～15小時(shí)，光照強(qiáng)度為2000～3000lx，培養(yǎng)溫度為25～28℃的條件下培養(yǎng)直至孢子萌發(fā)。

（4）增殖培養(yǎng)：將步驟（3）的孢子萌發(fā)開始，生長(zhǎng)80～100天后的原葉體切割成5mm×5mm大小并接種到增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行原葉體的增殖培養(yǎng)。接種后置于每天光照12～16小時(shí)，光照強(qiáng)度為2000～2500lx，培養(yǎng)溫度為25～28℃的條件下培養(yǎng)，約60天繼代一次。

（5）GGB的誘導(dǎo)：將步驟（4）增殖的帶有走莖的細(xì)嫩孢子體接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行GGB誘導(dǎo)培養(yǎng)。接種后置于每天光照12～16小時(shí)，光照強(qiáng)度為2000～2500lx，培養(yǎng)溫度為25～28℃的條件下培養(yǎng)，接種后每?jī)芍芨鼡Q一次培養(yǎng)基。

（6）GGB分化培養(yǎng)：將步驟（5）誘導(dǎo)得到的GGB轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基中進(jìn)行GGB分化培養(yǎng)。接種后置于每天光照12～16小時(shí)，光照強(qiáng)度為2000～2500lx，培養(yǎng)溫度為25～28℃的條件下培養(yǎng)。接種后每?jī)芍芨鼡Q一次培養(yǎng)基。

上述步驟（3）所述的萌發(fā)培養(yǎng)基為：MS+0.5～1.0mg/L6-BA+1～3mg/L?2,4-D+2.0%～3.5%蔗糖+0.35%～0.5%瓊脂，pH值為5.4～5.8。

上述步驟（4）所述的增殖培養(yǎng)基為：MS+0.1～0.5mg/L6-BA+0.5～1mg/L?2,4-D+2.0%～3.5%蔗糖+0.35%～0.5%瓊脂，pH值為5.4～5.8。