[發明專利]一種荷葉鐵線蕨離體再生體系的建立方法

有效

• 申請號: 201510087219.4
• 申請日: 2015-02-25
• 公開（公告）號: CN104663443B
• 公開（公告）日: 2017-01-11
• 發明（設計）人: 李軍;楊惠才
• 申請（專利權）人: 李軍
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 玉林市振盛專利商標代理事務所45109
• 代理人: 吳安儀

1.一種荷葉鐵線蕨離體再生體系的建立方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）外植體采取及處理：選擇孢子囊群蓋變為褐色、孢子囊群沒有開裂的孢子葉剪下,置于干燥紙袋中,自然晾干,5～7天后孢子囊自然開裂,孢子散落于紙袋中,清除袋內雜質,收集干燥的孢子置于離心管中,并將裝有孢子的離心管置于冰箱2～4℃保存備用;

（2）孢子的消毒：選取經步驟（1）處理后的孢子置于1.5mL離心管中，在離心管中加入1～2滴吐溫和適量蒸溜水,蓋上離心管蓋,稍稍搖晃后平放靜置3～8min，然后將孢子在混合液中震蕩均勻后轉移到快速濾紙上,通過漏斗將過濾的廢水用錐形瓶接住并迅速將該過濾裝置置于超凈工作臺中，先用無菌水沖洗3～5次后用70%～80%乙醇浸泡10～40s，用無菌水清洗3～5次后用0.1%升汞溶液消毒1～10min，再用無菌水清洗3～5次后備用;

（3）孢子萌發培養：將經步驟（2）處理后孢子配置成濃度為0.3～1.0mg/mL的孢子懸濁液接種于萌發培養基上進行孢子萌發培養,接種后置于每天光照12～15小時，光照強度為2000～3000lx，培養溫度為25～28℃的條件下培養直至孢子萌發;

（4）增殖培養：將步驟（3）的孢子萌發開始，生長80～100天后的原葉體切割成5mm×5mm大小并接種到增殖培養基上進行原葉體的增殖培養,接種后置于每天光照12～16小時，光照強度為2000～2500lx，培養溫度為25～28℃的條件下培養，約60天繼代一次;

（5）GGB的誘導：將步驟（4）增殖的帶有走莖的細嫩孢子體接種到誘導培養基上進行GGB誘導培養,接種后置于每天光照12～16小時，光照強度為2000～2500lx，培養溫度為25～28℃的條件下培養，接種后每兩周更換一次培養基;

（6）GGB分化培養：將步驟（5）誘導得到的GGB轉接到分化培養基中進行GGB分化培養,接種后置于每天光照12～16小時，光照強度為2000～2500lx，培養溫度為25～28℃的條件下培養,接種后每兩周更換一次培養基。

2.根據權利要求1所述的一種荷葉鐵線蕨離體再生體系的建立方法，其特征在于步驟（3）所述的萌發培養基為：MS+0.5～1.0mg/L6-BA+1～3mg/L?2,4-D+2.0%～3.5%蔗糖+0.35%～0.5%瓊脂，pH值為5.4～5.8。

3.根據權利要求1所述的一種荷葉鐵線蕨離體再生體系的建立方法，其特征在于步驟（4）所述的增殖培養基為：MS+0.1～0.5mg/L6-BA+0.5～1mg/L?2,4-D+2.0%～3.5%蔗糖+0.35%～0.5%瓊脂，pH值為5.4～5.8。

4.根據權利要求1所述的一種荷葉鐵線蕨離體再生體系的建立方法，其特征在于步驟（5）所述的GGB誘導培養基為：MS+0.01～0.5mg/L6-BA+1～3mg/L?NAA+2.0%～3.5%蔗糖+0.35%～0.5%瓊脂，pH值為5.4～5.8。

5.根據權利要求1所述的一種荷葉鐵線蕨離體再生體系的建立方法，其特征在于步驟（6）所述的GGB分化培養基為：MS+0.1～1.0mg/L?ZT+2.0%～3.5%蔗糖+0.35%～0.5%瓊脂，pH值為5.4～5.8。