[發明專利]一種類轉錄激活子效應蛋白介導的高效轉基因方法

有效

• 申請號: 201510085682.5
• 申請日: 2015-02-17
• 公開（公告）號: CN104651409B
• 公開（公告）日: 2018-04-20
• 發明（設計）人: 鐘伯雄;葉露鵬;錢秋杰;尤征英;車家倩;張玉玉;宋佳
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/89
• 分類號: C12N15/89;C12N15/85;C12N15/62;C12N15/54;A01K67/04
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司33200
• 代理人: 林超

技術領域

本發明涉及了一種轉基因方法，尤其是涉及了轉基因生物領域中的一種類轉錄激活子效應蛋白介導的高效轉基因方法。

背景技術

類轉錄激活子效應蛋白(TALE)是從病原菌屬Xanthomonas spp中分離得到的保守的細菌性效應蛋白，是一類可以特異識別DNA序列的蛋白。至今為止TALE已經廣泛應用于基因打靶、內源基因的定點調控和定點的表觀遺傳修飾。

在過去的十多年中，piggyBac轉座子介導的轉基因技術已經成功應用于大量的脊椎動物和非脊椎動物，成為了強大的遺傳操作工具，在制備轉基因動物和插入誘變等研究上發揮重要的作用。但是，piggyBac轉座子介導的轉基因效率依舊較低，而且轉化效率不穩定，近年來家蠶上的平均轉基因效率僅為8.8％。因此，轉基因效率的低下給研究人員增加了很大的工作負擔，很大程度上限制了該技術的進一步的推廣和應用。

發明內容

為了解決背景技術中存在的問題，本發明的目的是提供一種類轉錄激活子效應蛋白介導的高效轉基因方法，大大提高了piggyBac介導的在家蠶中的轉基因效率。

為了達到上述目的，本發明采用的技術方案的步驟如下：

1)采用分子生物學技術構建包含類轉錄激活子效應蛋白(TALE)DNA序列和piggyBac轉座酶(PBase)DNA序列的輔助質粒，該質粒表達有TALE-PBase融合蛋白，將該輔助質粒在體外轉錄成mRNA；

2)采用顯微注射法將作為轉座酶的輔助質粒的mRNA與含有外源基因的piggyBac轉座子質粒的DNA一起導入到動物的受精卵中，獲得外源基因能夠穩定遺傳和表達的轉基因動物；

3)根據標志基因或基因的表達特征篩選出轉基因陽性個體。

所述的輔助質粒中的類轉錄激活子效應蛋白DNA序列包括16個重復的DNA序列。

所述的輔助質粒中的類轉錄激活子效應蛋白DNA序列和piggyBac轉座酶DNA序列之間的Linker序列長度為209bp。

所述的輔助質粒中的類轉錄激活子效應蛋白序列位于PBase序列的5’端，類轉錄激活子效應蛋白序列和PBase序列表達后為一個融合蛋白。

所述的piggyBac轉座子質粒中含有至少一種外源基因的表達框。

由本發明實施例，piggyBac轉座子質粒包含有綠色熒光蛋白基因(EGFP)、紅色熒光蛋白基因(DsRed)和家蠶絲素輕鏈啟動子啟動人血清白蛋白(HSA)中的一種或者多種的表達框。

本發明具有的有益效果是：

本發明極大地推動了轉基因技術的發展，將目前piggyBac介導的在家蠶中的轉基因效率至少提高了7倍，這將是轉基因技術發展中的一次重要突破。同時，其它動物的piggyBac轉座子介導的轉基因效率也因本技術的發明而得到顯著提高。因此，在今后的研究中，獲得轉基因動物將會變得非常容易，這很大程度上簡化了轉基因實驗的過程，也節省了大量的人力和物力。

附圖說明

圖1是本發明TALE-PBase新型輔助質粒結構圖。

圖2是實施例1具有3×P3-EGFP表達框的piggyBac轉座子質粒結構圖。

圖3是實施例3具有3×P3-DsRed和FL-HSA兩個表達框的piggyBac轉座子質粒結構圖。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明作進一步說明。

實施例1：

以提高動物轉基因效率為研究目的，構建了一個包含類轉錄激活效應蛋白(TALE)DNA序列和piggyBac轉座酶(PBase)DNA序列(基因如SEQ ID NO.5)的新型輔助質粒(圖1)。具體方法是：先組裝TALE序列(如SEQ ID NO.3)；在TALE的3’端(COON端)連接一個PBase序列，與前面的TALE序列在同一個編碼框內，用于表達TALE-PBase融合蛋白，TALE與PBase之間有1個209bp長度連接序列(Linker)(如SEQ ID NO.4)連接；在TALE的5’端(NH₂端)構建一個SP6原核啟動子(如SEQ ID NO.1)，該啟動子可以將下游基因在體外轉錄成mRNA；還構建了一個核定位序列(NLS)(如SEQ ID NO.2)，用于引導TALE-PBase融合蛋白進入細胞核。