[發(fā)明專利]一種類轉(zhuǎn)錄激活子效應(yīng)蛋白介導(dǎo)的高效轉(zhuǎn)基因方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510085682.5
• 申請(qǐng)日: 2015-02-17
• 公開（公告）號(hào): CN104651409B
• 公開（公告）日: 2018-04-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鐘伯雄;葉露鵬;錢秋杰;尤征英;車家倩;張玉玉;宋佳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/89
• 分類號(hào): C12N15/89;C12N15/85;C12N15/62;C12N15/54;A01K67/04
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司33200
• 代理人: 林超

1.一種類轉(zhuǎn)錄激活子效應(yīng)蛋白介導(dǎo)的高效轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于該方法的步驟如下：

1）采用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建包含類轉(zhuǎn)錄激活子效應(yīng)蛋白DNA序列和piggyBac轉(zhuǎn)座酶DNA序列的輔助質(zhì)粒，該質(zhì)粒表達(dá)有TALE-PBase融合蛋白，將該輔助質(zhì)粒在體外轉(zhuǎn)錄成mRNA；

輔助質(zhì)粒采用以下方式構(gòu)建：先組裝如SEQ ID NO.3的TALE序列；在TALE的3’端連接一個(gè)PBase序列，與前面的TALE序列在同一個(gè)編碼框內(nèi)，用于表達(dá)TALE-PBase融合蛋白，TALE與PBase之間有1個(gè)209bp長(zhǎng)度的如SEQ ID NO.4的連接序列連接；在TALE 的5’端構(gòu)建一個(gè)如SEQ ID NO.1的SP6原核啟動(dòng)子，還構(gòu)建了一個(gè)如SEQ ID NO.2的核定位序列；

2）采用顯微注射法將作為轉(zhuǎn)座酶的輔助質(zhì)粒的mRNA與含有外源基因的piggyBac轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒的DNA一起導(dǎo)入到動(dòng)物的受精卵中，獲得外源基因能夠穩(wěn)定遺傳和表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，所述的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物為家蠶；

3）根據(jù)標(biāo)志基因或基因的表達(dá)特征篩選出轉(zhuǎn)基因陽性個(gè)體。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種類轉(zhuǎn)錄激活子效應(yīng)蛋白介導(dǎo)的高效轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于：所述的輔助質(zhì)粒中的類轉(zhuǎn)錄激活子效應(yīng)蛋白DNA序列包括16個(gè)重復(fù)的DNA序列。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種類轉(zhuǎn)錄激活子效應(yīng)蛋白介導(dǎo)的高效轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于：所述的輔助質(zhì)粒中的類轉(zhuǎn)錄激活子效應(yīng)蛋白DNA序列和piggyBac轉(zhuǎn)座酶DNA序列之間的Linker序列長(zhǎng)度為209bp。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種類轉(zhuǎn)錄激活子效應(yīng)蛋白介導(dǎo)的高效轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于：所述的輔助質(zhì)粒中的類轉(zhuǎn)錄激活子效應(yīng)蛋白序列位于PBase序列的5’端，兩者表達(dá)后為一個(gè)融合蛋白。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種類轉(zhuǎn)錄激活子效應(yīng)蛋白介導(dǎo)的高效轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于：所述的piggyBac轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒中含有至少一個(gè)外源基因的表達(dá)框。