[發明專利]微生物發酵生產低溫γ-內酰胺酶的方法

在審

• 申請號: 201510084710.1
• 申請日: 2015-02-16
• 公開（公告）號: CN104630196A
• 公開（公告）日: 2015-05-20
• 發明（設計）人: 李曉艷;王曉輝;竇少華;于爽;張慶芳;遲乃玉;張旭姣;王強;金連豆
• 申請（專利權）人: 大連大學
• 主分類號: C12N9/86
• 分類號: C12N9/86
• 代理公司: 大連智高專利事務所(特殊普通合伙) 21235
• 代理人: 胡景波

1.一種微生物發酵生產低溫γ-內酰胺酶的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)將能產生γ-內酰胺酶菌種先活化，再逐級低溫馴化，馴化溫度由高到低，30℃→25℃→22℃→20℃→18℃→16℃→14℃→12℃→10℃，當菌種在低溫環境中穩定生長即馴化結束；該菌種的低溫馴化培養基組成為：酵母膏0.2～5.0g，N-乙酰-L-苯丙氨酸1.0～10.0g，NH₄Cl2.0～15.0g，Na₂HPO₄0.1～1.0g，NaH₂PO₄0.1～1.0g，MgSO₄0.05～0.5g，瓊脂粉20g，自來水1.0L，pH為6.0～8.0，于103kpa，121℃高壓蒸汽滅菌30min；

所述的能產生γ-內酰胺酶菌種來源于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，菌種編號：1.219或1.758或1.1830；

(2)按常規方法將步驟(1)中低溫馴化后的γ-內酰胺酶產生菌在液體種子培養基中于10～16℃逐級擴大培養，制備成液體一級種子和二級種子；所述的液體種子培養基：酵母膏20.0～25.0g，蛋白胨10.0～20g，NaCl?10.0～15.0g，MgSO₄0.05～0.5g，ZnSO₄·7H₂O?2.4～8.0mg，自來水1.0L，pH為6.0～8.0，于103kpa，121℃高壓蒸汽滅菌30min；

(3)將液體二級種子按發酵液體積的3～9％接種量接入液體產酶培養基中，在10～16℃培養72～144h時，即微生物發酵生產低溫γ-內酰胺酶結束；所述的液體產酶培養基：牛肉膏10.0～25.0g，蛋白胨2.0～20.0g，乙酰胺5.0～20g，Tween800.1～0.4g，(NH₄)₂SO₄1.0～1.5g，KH₂PO₄1.4～2.0g，MgSO₄0.1～0.4g，CaCl₂0.2～0.3g，ZnSO₄·7H₂O?2.4～8.0mg，自來水1.0L，pH為5.0～8.0，于103kpa，121℃高壓蒸汽滅菌30min；

(4)將步驟(3)的發酵液在4000～8000rpm離心收集菌體，超聲破碎，收集到的上清液即為粗酶液；

(5)根據不同需要和使用對象不同，還可以將步驟(4)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。

2.根據權利要求1所述的一種微生物發酵生產低溫γ-內酰胺酶的方法，其特征在于，步驟(1)產生γ-內酰胺酶菌種的活化培養基為：酵母膏20.0g，蛋白胨10.0g，NaCl10.0g，瓊脂20.0g，自來水1.0L，pH7.4，于103kpa，121℃高壓蒸汽滅菌30min。