[發(fā)明專利]海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫葡萄糖氧化酶的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510084670.0
• 申請(qǐng)日: 2015-02-16
• 公開（公告）號(hào): CN104630167A
• 公開（公告）日: 2015-05-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王曉輝;李曉艷;竇少華;于爽;張慶芳;遲乃玉;王強(qiáng);張旭姣;金連豆
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 大連大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/04
• 分類號(hào): C12N9/04
• 代理公司: 大連智高專利事務(wù)所(特殊普通合伙) 21235
• 代理人: 胡景波

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物學(xué)、酶工程、發(fā)酵工程、生物化學(xué)等領(lǐng)域，具體涉及一種低溫葡萄糖氧化酶海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)方法。

背景技術(shù)

葡萄糖氧化酶(Glucose?oxidase,E.C?1.1.3.4,簡(jiǎn)寫為GOD)在有氧條件下專一性催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和過氧化氫(Ahmed?H等，Eur?Biophys?J，1998)。GOD主要分布于動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)，其中動(dòng)、植物組織中GOD含量有限，而微生物由于其自身具有來源廣泛、生長(zhǎng)周期短等優(yōu)點(diǎn)，是生產(chǎn)GOD的主要來源，目前，GOD的主要生產(chǎn)菌株為黑曲霉和青霉(王志新等，中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2007)。早期GOD的生產(chǎn)主要從動(dòng)、植物體內(nèi)提取，但該方法很難得到純度高的GOD,而微生物發(fā)酵法具有發(fā)酵生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，提取步驟相對(duì)簡(jiǎn)易，酶的純化工藝穩(wěn)定，生產(chǎn)不受原料來源影響等特點(diǎn)，且生產(chǎn)的GOD在安全性方面具有更大優(yōu)勢(shì)，適用于批量生產(chǎn)，容易實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，還可以與食品生產(chǎn)、飼料生產(chǎn)和醫(yī)藥檢測(cè)材料聯(lián)合在一起，具有廣闊市場(chǎng)應(yīng)用前景(邢良英等，食品科技，2007；張?jiān)绖椎龋暳瞎I(yè)，2011)。國(guó)外對(duì)GOD的研究比較早，主要在菌種篩選、產(chǎn)酶條件的優(yōu)化、酶的分離純化、酶學(xué)特性以及GOD基因的克隆與表達(dá)等方面都有深入研究(Sisak?C等，Enzyme?and?Microbial?Technology,2006；Mislovicova?D等，Process?Biochemistry,2007；)。相比國(guó)外，我國(guó)有關(guān)GOD的研究工作起步較晚(朱運(yùn)平等，中國(guó)食品添加劑，2013)目前我國(guó)雖有GOD產(chǎn)品出售，但酶制劑純度及活性普遍較低，穩(wěn)定性差，生產(chǎn)成本較高，主要依賴進(jìn)口(韓建春等，食品科學(xué)，2011)。

低溫酶在低溫下具有高酶活力及高催化效率，可大大縮短處理過程的時(shí)間并省卻昂貴的加熱或冷卻費(fèi)用；在節(jié)能方面有相當(dāng)大的優(yōu)勢(shì)；經(jīng)過溫和的熱處理即可使低溫酶的活力喪失，而低溫或適溫處理不會(huì)影響產(chǎn)品的品質(zhì)(陸小波等，生物技術(shù)通報(bào)，2006；曾胤新等，中國(guó)生物工程雜志，2003)低溫GOD利用低溫酶上述優(yōu)點(diǎn)使其具有非常廣闊的開發(fā)潛力和應(yīng)用前景。低溫GOD將為人類擺脫生存和發(fā)展中所面臨的諸如疾病、資源、能源危機(jī)以及環(huán)境污染等困境提供現(xiàn)實(shí)的機(jī)遇，具有非常廣闊的開發(fā)潛力和應(yīng)用前景。目前國(guó)內(nèi)外未見低溫GOD的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫葡萄糖氧化酶的方法，該方法主要是微生物經(jīng)過低溫馴化后，在10～16℃液體發(fā)酵生產(chǎn)低溫葡萄糖氧化酶的方法，這種生產(chǎn)方法獲得的低溫葡萄糖氧化酶粗酶液活性可以達(dá)到227.1U/ml，如再經(jīng)過分離和純化，可以得到不同濃度和純度的酶制劑。本發(fā)明所述的一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫葡萄糖氧化酶的方法具體包括以下步驟：

(1)將能產(chǎn)生葡萄糖氧化酶的菌種先活化，再經(jīng)過逐級(jí)低溫馴化，馴化溫度由高到低，25℃→22℃→20℃→18℃→16℃→14℃→12℃→10℃，使其在低溫環(huán)境中生長(zhǎng)良好，當(dāng)菌種能在低溫下穩(wěn)定生長(zhǎng)即馴化結(jié)束；該菌種的低溫馴化培養(yǎng)基為：葡萄糖20.0～50.0g，蛋白胨1.0～5.0g，(NH₄)₂SO₄?2.0～3.0g，CaCO₃?1.0～5.0g，pH值為自然，于103kpa、121℃高壓蒸氣滅菌30min；

所述的能產(chǎn)生葡萄糖氧化酶的菌種來源于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，菌種編號(hào)：1.10601或1.6446或1.10904；

(2)按常規(guī)方法將步驟(1)中低溫馴化后的葡萄糖氧化酶產(chǎn)生菌在液體種子培養(yǎng)基中于10～16℃逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，制備成液體一級(jí)種子和二級(jí)種子；所述的液體種子培養(yǎng)基為：蛋白胨7.0～12.0g,牛肉膏2.0～7.0g,NaCl?8.0～11.0g,pH值為自然,于103kpa、121℃高壓蒸氣滅菌30min；

(3)將液體二級(jí)種子按發(fā)酵液體積3～9％的接種量接入液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在10～16℃培養(yǎng)72～144h時(shí)，即微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫葡萄糖氧化酶結(jié)束；所述的液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基為：葡萄糖75.0～85.0g,蛋白胨1.0～5.0g,KH₂PO₄?1.4～2.0g,MgSO₄·7H₂O?0.7～0.8g,KCl?0.2～0.6g,pH值為5.6,于103kpa、121℃高壓蒸氣滅菌30min；