[發明專利]海洋微生物發酵生產低溫脂肪氧合酶的方法

在審

• 申請號: 201510084631.0
• 申請日: 2015-02-16
• 公開（公告）號: CN104630164A
• 公開（公告）日: 2015-05-20
• 發明（設計）人: 竇少華;李曉艷;王曉輝;于爽;張慶芳;遲乃玉;張旭姣;王強;金連豆
• 申請（專利權）人: 大連大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02
• 代理公司: 大連智高專利事務所(特殊普通合伙) 21235
• 代理人: 胡景波

技術領域

本發明涉及微生物學、酶工程、發酵工程、生物化學等領域，具體涉及一種低溫脂肪氧合酶海洋微生物發酵生產方法。

背景技術

脂肪氧合酶(Lipoxygenase,EC?1.13.11.12,簡稱LOX)是一類含有非血紅素鐵的雙加氧酶，其催化生成的不飽和脂肪酸氫過氧化物，是面粉增白劑和增香劑、抗腫瘤藥物前體、涂料與洗滌劑等的生產原料，是重要的藥物合成和化學合成中間體，具有巨大的市場需求。工業使用LOX大多是植物來源的LOX，絕大部分來源于大豆。由于工藝成本的限制，大豆提取的LOX往往含有多種同工酶，對控制其催化產物特性非常不利(Casey?R,et?al.Food?Biotechnol,2005)。與傳統提取法相比，海洋微生物發酵得到的LOX性能穩定，其良好的同質性受到了越來越多的關注。現階段國內外對微生物來源LOX的研究主要集中于中溫LOX，研究內容包括菌種選育、發酵優化(陸信曜，食品科技，2013)、酶學性質、結構及催化特性、固定化、基因的克隆與表達以及酶蛋白分子改造等方面(Casey?R,et?al.Trends?Food?Sci?Tech,1999；Koeduka?T,et?al.Curr?Microbi-ol,2007；張充等，生物工程學報，2012；章棟梁等，核農學報，2012；Hansen?J,et?al.Appl?Microbiol?Biot,2013；王廣圣等，食品科技，2014等)，低溫酶在低溫下具有高酶活力及高催化效率，可減少加工工藝，縮短加工過程的時間并省卻昂貴的加熱或冷卻費用，在節能方面有相當大的優勢；經過溫和的熱處理即可使低溫酶的活力喪失，而低溫或適溫處理不會影響產品的品質(陳秀蘭等，中國農業科技導報，2007)。因此，低溫LOX同樣具備的上述特性將有助于其推廣和應用，具有更廣闊的工業開發價值與市場應用優勢。目前，還未見有關海洋微生物發酵生產低溫LOX、低溫LOX產業化、規模化生產的相關報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種海洋微生物發酵生產低溫脂肪氧合酶的方法，該方法主要是微生物經過低溫馴化后，在10～18℃液體發酵培養基中發酵生產低溫脂肪氧合酶的方法，這種生產方法獲得的低溫脂肪氧合酶粗酶液酶活可以達到170U/ml，如再經過分離和純化，可以得到不同濃度和純度的酶制劑。

本發明的技術方案如下：微生物發酵生產低溫脂肪氧合酶的方法具體包括以下步驟：

(1)將能產生脂肪氧合酶的菌種活化，再經過逐級低溫馴化，馴化溫度由高到低，30℃→25℃→22℃→20℃→18℃→16℃→14℃→12℃→10℃，使其在低溫環境中生長良好；該菌種的低溫馴化培養基為：蛋白胨5.0～15.0g，亞油酸2.0～10.0g，NaCl?5.0～10.0g，L-天冬氨酸0.5～2.0g，L-谷氨酸0.5～2.0g，瓊脂20.0g，自來水1.0L，pH值為6.0～8.0，于103kpa、121℃高壓蒸汽滅菌30min；

所述的能產生脂肪氧合酶的微生物來源于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，菌種編號：1.228或1.239或1.2620；

(2)按常規方法將步驟(1)中低溫馴化后的脂肪氧合酶產生菌在液體種子培養基中于10～18℃逐級擴大培養，制備成液體一級種子和二級種子；所述的液體種子培養基:酵母膏10.0～20.0g，蛋白胨5.0～10.0g，NaCl5.0～10.0g，L-天冬氨酸0.5～2.0g，L-谷氨酸0.5～2.0g，自來水1.0L，pH值為6.0～8.0，于103kpa、121℃高壓蒸汽滅菌30min

(3)將液體二級種子按發酵液體積3～9％的接種量接入液體產酶培養基中，在10～18℃培養72～144h時，即海洋微生物發酵生產低溫脂肪氧合酶結束；所述的液體產酶培養基:牛肉膏3.0～10.0g，蛋白胨5.0～10.0g，NaCl5.0～10.0g，L-天冬氨酸0.5～2.0g，L-谷氨酸0.5～2.0g，Tween800.1～0.4g，(NH₄)₂SO₄1.0～1.5g，KH₂PO₄1.0～2.0g，MgSO₄0.1～0.5g，CaCl₂0.1～0.3g，ZnSO₄·7H₂O?2.4～3.0mg，自來水1.0L，pH值為6.0～7.0，于103kpa、121℃高壓蒸汽滅菌30min；