[發明專利]海洋微生物發酵生產低溫脂肪氧合酶的方法

在審

• 申請號: 201510084631.0
• 申請日: 2015-02-16
• 公開（公告）號: CN104630164A
• 公開（公告）日: 2015-05-20
• 發明（設計）人: 竇少華;李曉艷;王曉輝;于爽;張慶芳;遲乃玉;張旭姣;王強;金連豆
• 申請（專利權）人: 大連大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02
• 代理公司: 大連智高專利事務所(特殊普通合伙) 21235
• 代理人: 胡景波

1.一種海洋微生物發酵生產低溫脂肪氧合酶的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)將能產生脂肪氧合酶的菌種活化，再經過逐級低溫馴化，馴化溫度由高到低，30℃→25℃→22℃→20℃→18℃→16℃→14℃→12℃→10℃，使其在低溫環境中生長良好；該菌種的低溫馴化培養基為：蛋白胨5.0～15.0g，亞油酸2.0～10.0g，NaCl?5.0～10.0g，L-天冬氨酸0.5～2.0g，L-谷氨酸0.5～2.0g，瓊脂20.0g，自來水1.0L，pH值為6.0～8.0，于103kpa、121℃高壓蒸汽滅菌30min；

所述的能產生脂肪氧合酶的微生物來源于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，菌種編號：1.228或1.239或1.2620；

(2)按常規方法將步驟(1)中低溫馴化后的脂肪氧合酶產生菌在液體種子培養基中于10～18℃逐級擴大培養，制備成液體一級種子和二級種子；所述的液體種子培養基為:酵母膏10.0～20.0g，蛋白胨5.0～10.0g，NaCl5.0～10.0g，L-天冬氨酸0.5～2.0g，L-谷氨酸0.5～2.0g，自來水1.0L，pH值為6.0～8.0，于103kpa、121℃高壓蒸汽滅菌30min

(3)將液體二級種子按發酵液體積3～9％的接種量接入液體產酶培養基中，在10～18℃培養72～144h時，即海洋微生物發酵生產低溫脂肪氧合酶結束；所述的液體產酶培養基為:牛肉膏3.0～10.0g，蛋白胨5.0～10.0g，NaCl5.0～10.0g，L-天冬氨酸0.5～2.0g，L-谷氨酸0.5～2.0g，Tween800.1～0.4g，(NH₄)₂SO₄?1.0～1.5g，KH₂PO₄?1.0～2.0g，MgSO₄?0.1～0.5g，CaCl₂?0.1～0.3g，ZnSO₄·7H₂O?2.4～3.0mg，自來水1.0L，pH值為6.0～7.0，于103kpa、121℃高壓蒸汽滅菌30min；

(4)將步驟(3)的發酵液在4,000～10,000rpm離心收集菌體，超聲破碎，收集到的上清液即為粗酶液；

(5)根據不同需要和使用對象不同，還可以將(4)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。

2.根據權利要求1所述的海洋微生物發酵生產低溫脂肪氧合酶的方法，其特征在于，步驟(1)產生脂肪氧合酶的菌種活化培養基為：酵母膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl?10.0g，瓊脂20.0g，自來水1.0L，pH值為7.0，于103kpa、121℃高壓蒸汽滅菌30min。