[發明專利]對血液中抑制劑具有增加的抗性的熱穩定性A型DNA聚合酶突變體

有效

• 申請號: 201510081106.3
• 申請日: 2015-02-13
• 公開（公告）號: CN104845950B
• 公開（公告）日: 2020-03-27
• 發明（設計）人: N·麥金尼;H·H·霍格雷非;J·福克斯;C·J·漢森;B·阿雷齊
• 申請（專利權）人: 安捷倫科技有限公司
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C12N15/54;C12Q1/6806
• 代理公司: 北京坤瑞律師事務所 11494
• 代理人: 封新琴

本發明提供了具有增強的對DNA聚合酶活性抑制劑的抗性的DNA聚合酶突變體。所述突變體聚合酶特別適合于含有野生型聚合酶抑制劑的樣品中的靶標的PCR擴增。

相關申請的交叉引用

本申請要求2014年2月14日提交的美國臨時申請No.61/940,172的優先權。將該申請的內容通過提述完整并入本文。

技術領域

本發明涉及分子生物學領域。更具體地說，本發明涉及改進的用于進行聚合酶鏈式反應(PCR)的聚合酶并涉及進行PCR的方法。

發明背景

PCR是應用最廣泛的核酸檢測方法之一。該方法在感染性疾病和遺傳性紊亂的研究和分子診斷中具有廣泛應用。在許多應用中，對基于血液的PCR診斷的需求尤多。

一方面，血液是人體循環系統的一個重要部分。它包括許多類型的宿主細胞，包括正常細胞、病變細胞(例如，循環腫瘤細胞)，并且，如果宿主是懷孕的母親，還包括胎兒細胞，以及來自這種細胞的遺傳物質，比如microRNA。事實上，基于血液的PCR由于其最小介入性在一些情況下，諸如使用母體血液樣品進行胎兒診斷時具有優勢，其沒有與常規羊水檢查相關的流產風險。在某些情況下，血液也含有病原體，如病毒和細菌。對應地，基于血液的診斷可以提供人體內任何給定的時間的情況的即時圖景。在另一方面，血液是用于在許多創傷或病理情況下提高生活質量和挽救生命的各種藥品和血液制品(例如全血、血漿、抗體、和干細胞)的來源。血液、血漿、和其他血源性成分的治療用途要求這些成分的捐獻盡可能地不受病變細胞(例如腫瘤細胞)或病原體(例如HIV、HBV、和HCV)的污染。參閱，例如，美國申請20130316925、20130157253、20120329061、20120070827、20120034614、20070281307、和20070105121。

然而，基于血液的PCR診斷受到了許多后勤和技術挑戰的限制。來自生物樣品的核酸診斷(nucleic acid diagnostics)伴隨著多方面的挑戰。復雜生物樣 品，諸如血液和細胞裂解液，具有多種能抑制PCR反應中使用的DNA聚合酶的組分。這些組分包括血液中的血紅蛋白、免疫球蛋白G、乳鐵蛋白和蛋白酶。盡管已經開發了在嘗試PCR反應之前純化樣品的各種規程，但這些步驟通常耗時、費力，并且可能達不到后續PCR所要求的純化。此外，含有核酸的細胞(例如白細胞和胎兒細胞)僅僅占了血樣的一小部分，寶貴的核酸可能在PCR反應步驟之前從樣品中丟失。

當操作血液時，一個關鍵點在于血樣應該收集在抗凝劑中以防凝固，因為從凝固的血中分離核酸的效率低下，且大多數細胞將損失在凝塊中。然而，在血樣收集中例行使用的抗凝劑，如EDTA和肝素等，會干擾或抑制PCR。例如，肝素是高度帶負電荷的，會與DNA共提取，從而抑制PCR反應。參閱，例如，García等J.Clin.Microbiol.2002年4月第40卷第4期1567-1568，和Yokota等Journal of Clinical Laboratory Analysis，第13卷，第3版，第133–140頁，1999。

因此，需要對上述抑制劑更具抗性且適用于使用血樣的PCR反應的試劑，如DNA聚合酶。

發明內容

本發明涉及熱穩定性A型DNA聚合酶突變體，其對全血中的抑制劑具有增加的抗性，所述抑制劑包括天然血液組分(紅細胞中的血紅蛋白、白細胞中的乳鐵蛋白)或血漿(免疫球蛋白G)、或添加的抗凝劑(如EDTA和肝素)。