[發明專利]一種小鼠Loxl3基因條件性敲除的方法與應用

有效

• 申請號: 201510080652.5
• 申請日: 2015-02-13
• 公開（公告）號: CN104651400B
• 公開（公告）日: 2017-06-06
• 發明（設計）人: 張劍;高建剛;侯從哲;楊瑞;劉子熠
• 申請（專利權）人: 山東大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12Q1/68
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司37219
• 代理人: 朱家富

技術領域

本發明涉及一種小鼠Loxl3基因條件性敲除的方法與應用，屬于基因工程技術領域。

背景技術

自從人類基因組計劃完成以后，生命科學研究進入了后基因組時代，而后基因組時代的核心工作是研究基因的功能。目前，研究基因功能最有效的方法是基因打靶(基因敲除和基因敲入)技術。基因打靶技術是近年來在生命科學研究領域發展起來的一項新技術，它是在胚胎干細胞(embryonic stem cell，ES)技術和同源重組技術的基礎上發展起來的，可以定向操作和改變基因，然后通過觀察和分析被改變基因動物的表型來獲得基因功能的信息。基因打靶技術還有另外一種重要用途——制作人類疾病的動物模型。

現有研究顯示，人類很多疾病是由于基因突變引起的，基因打靶技術可以精確操縱動物染色體上的基因，從而制作出具有同人類疾病完全一樣病癥的動物模型，這對于查清人類疾病的致病機理，特別是在尋找治療人類疾病的特效藥物方面有非常重要的實踐意義。

美國北卡洛萊娜大學Oliver Smithies由于兩項科學貢獻而獲得了2007年Nobel生理學醫學獎，一是把基因打靶所需的同源重組技術首先應用在哺乳動物細胞中，二是使用基因打靶技術制作了一些人類疾病的動物模型。他在諾貝爾頒獎大會上演講的題目就是“讓我們制作更多的人類疾病動物模型”。

腭裂(Cleft Palate,CP)是在新生兒中較為常見的先天性顱面部發育畸形，全世界范圍內新生兒發病率為1/700，而在我國新生兒中的發病率為1.82‰，中國是目前世界上唇腭裂患者數量最多的國家之一。腭裂的病因極其復雜，對腭裂的發病原因及其發病機制仍不清楚。因而，目前迫切需要提供一種可用于腭裂發病機制研究的小鼠模型。LOXL3(lysyl oxidase-like3)是賴氨酰氧化酶家族成員之一。賴氨酰氧化酶是一種細胞外銅依賴氨基酸氧化酶。在人和多種動物中，賴氨酰氧化酶能將膠原和彈性蛋白中特定賴氨酸的ε-氨基氧化脫氨從而使二者交聯，而這兩者又是主要的細胞外基質結構蛋白。膠原蛋白是參與腭的發育的重要蛋白，而且已有研究表明抑制膠原的交聯將導致腭裂的形成。小鼠Loxl3基因定位在6號染色體上。目前，有關小鼠Loxl3基因的敲除還未見報道。

發明內容

本發明針對現有技術的不足，提供一種小鼠Loxl3基因條件性敲除的方法與應用。

本發明的技術方案如下：

一種小鼠Loxl3基因條件性敲除的方法，出生后純合敲除小鼠表現腭裂癥狀，包括如下步驟：

構建Loxl3條件性基因敲除的重組載體，

線性化重組載體并轉染胚胎干細胞，

篩選發生同源重組的胚胎干細胞克隆，

將篩選出的發生同源重組的胚胎干細胞克隆顯微注入C57BL/6供體小鼠的囊胚，

將含有陽性胚胎干細胞的囊胚移植到假孕小鼠的子宮，生產出嵌合體小鼠，

嵌合體小鼠與C57BL/6小鼠回交生出雜合子小鼠，

將該雜合子小鼠與全身性表達Cre酶的EIIa-Cre小鼠交配，獲得雙雜合的小鼠，

雌性和雄性雙雜合小鼠互交，從后代中獲得具有腭裂表型的純合基因敲除小鼠。

根據本發明優選的，所述的構建Loxl3條件性基因敲除的重組載體，步驟如下：

(1)提取含有loxl3基因的細菌人工染色體(BAC)；

(2)PCR擴增六段同源重組片段，所述的引物序列分別為：

同源重組片段A：F：GGACTAGTAGCAGCTTCAGCTTCAGACAC；

R：CGGGATCCTGGTCTCTGTCTCGGTGACTC；

同源重組片段B：F：CGGGATCCGGGCCTTGAAAGTTCAGAGTT；

R：GCTCTAGACACTAGCACCACGTTCTACCC；

同源重組片段C：F：ACGCGTCGACTCTAACTGCATGGGTCTTGCT；

R：GGAATTCCACCATAACCTTCCCTGGTTT；

同源重組片段D：F：CGGGATCCTTTGCAAAGGGAAAGGAGAGT；