[發(fā)明專利]一種小鼠Loxl3基因條件性敲除的方法與應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510080652.5
• 申請日: 2015-02-13
• 公開（公告）號: CN104651400B
• 公開（公告）日: 2017-06-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張劍;高建剛;侯從哲;楊瑞;劉子熠
• 申請（專利權(quán)）人: 山東大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12Q1/68
• 代理公司: 濟南金迪知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司37219
• 代理人: 朱家富

1.一種小鼠Loxl3基因條件性敲除的方法，其特征在于，出生后純合敲除小鼠表現(xiàn)腭裂癥狀，包括如下步驟：

構(gòu)建Loxl3條件性基因敲除的重組載體，步驟如下：

(1)提取含有l(wèi)oxl3基因的細菌人工染色體(BAC)；

(2)PCR擴增六段同源重組片段，所述的引物序列分別為：

同源重組片段A：F：GGACTAGTAGCAGCTTCAGCTTCAGACAC；

R：CGGGATCCTGGTCTCTGTCTCGGTGACTC；

同源重組片段B：F：CGGGATCCGGGCCTTGAAAGTTCAGAGTT；

R：GCTCTAGACACTAGCACCACGTTCTACCC；

同源重組片段C：F：ACGCGTCGACTCTAACTGCATGGGTCTTGCT；

R：GGAATTCCACCATAACCTTCCCTGGTTT；

同源重組片段D：F：CGGGATCCTTTGCAAAGGGAAAGGAGAGT；

R：ATAAGAATGCGGCCGCCTAGTCCAGAGCATCGCTCAC；

同源重組片段E：F：CCGCTCGAGCTGGACTAGCCCGGACATTAT；

R：GGAATTCCATTCGGATACCATTCACCTGC；

同源重組片段F：F：CGGGATCCACCAGCAAGCAGGAACTCAT；

R：ATAAGAATGCGGCCGCTGTTTGTTTCTGTGCCAAGC；

(3)分別將同源重組片段A和同源重組片段B連入質(zhì)粒pL253，同源重組片段C和同源重組片段D連入質(zhì)粒pL452，同源重組片段E和同源重組片段F連入質(zhì)粒pL451，分別制得重組質(zhì)粒pL253+A+B、重組質(zhì)粒pL452+C+D、重組質(zhì)粒pL451+E+F；

(4)將含有l(wèi)oxl3基因的BAC轉(zhuǎn)化入EL350菌株，然后通過第一次同源重組，將質(zhì)粒pL253+A+B轉(zhuǎn)化入含有BAC的EL350菌株，獲得Retrieved質(zhì)粒；再通過第二次同源重組，將重組質(zhì)粒pL452+C+D和Retrieved質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化入EL350菌株，獲得含有A+C+Neo+D+B片段的二次同源重組質(zhì)粒；利用Cre-loxP系統(tǒng)去除Neo序列，獲得去掉Neo的二次同源重組質(zhì)粒；最后通過第三次同源重組，將重組質(zhì)粒pL451+E+F和去掉Neo的二次同源重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化入EL350菌株，獲得含有A+C+D+E+Neo+F+B片段的三次同源重組質(zhì)粒，即為Loxl3條件性基因敲除的重組載體；

線性化重組載體并轉(zhuǎn)染胚胎干細胞；

篩選發(fā)生同源重組的胚胎干細胞克??；

將篩選出的發(fā)生同源重組的胚胎干細胞克隆顯微注入C57BL/6供體小鼠的囊胚；

將含有陽性胚胎干細胞的囊胚移植到假孕小鼠的子宮，生產(chǎn)出嵌合體小鼠；

嵌合體小鼠與C57BL/6小鼠回交生出雜合子小鼠；

將該雜合子小鼠與全身性表達Cre酶的EIIa-Cre小鼠交配，獲得雙雜合的小鼠；

雌性和雄性雙雜合小鼠互交，從后代中獲得具有腭裂表型的純合基因敲除小鼠。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的胚胎干細胞為129/S6來源的胚胎干細胞。

3.利用權(quán)利要求1所述的方法獲得的純合基因敲除小鼠作為腭裂疾病發(fā)病研究的模型鼠的用途。